1、 本科毕业论文 （ 20 届） 五味子等提取物的抑菌活性研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 2 目录 摘 要 . 1 ABSTRACT . 2 1 前言 . 3-4 2 实验材料 主要仪器与试剂 . 4 2.1 实验材料 . 4 2.2 实验菌种 . 4 2.3 主要试剂 .4 2.4 主 要仪器 .4 2.5 培养基及缓冲液配制 . .4 3 实验方法 .5 3.1 提取 .5 3.2 检测平板的制备 .5 3.3 试验 菌种的活化 . 5 3.4 指示菌菌悬液的制备 .5 3.5 抑菌试验 .6 3.6 乙醇提取因素水平表 .6 3.7 五味子
2、提取物抑菌性的影响因素实验 .6 4 实验结果与讨论 .7 4.1 不同溶剂提取工艺的优化 .7 4.2 最低抑菌浓度的测定 .8 4.3 乙醇的最佳提取工艺优化 .9 4.4 pH 值对五味子提取物抑菌效力的影响 . .10 4.5 紫外光对五味子提取物抑菌效力的影响 .11 4.6 五味子提取物抑菌性的热稳定性实验 .11 5 小结 . 12 参考文献 .12-13 致谢 . 14 3 摘要 目的 探讨五味子提取物的体外抑菌活性 , 为其合理开发提供依据。 方法 采用乙醇、 50%甲醇 及水 3 种溶剂对五味子进行搅拌提取 , 以金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌为供试菌 , 通过打孔
3、法测最低抑菌浓度 (MIC) 。结果 五味子 3 种提取物对金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用 , 其中 乙醇 提取物的抑制效果最明显 , 其次是 50%甲醇 提取物 , 最后是水提 取物 ; MIC 分别为 25、 50 和 75 mg/ ml 。同时 , 低浓度的乙醇提取物体外抑菌作用不明显 , 浓度为 62. 5 mg/ ml 时细菌的生长被完全抑制 , 但没有明显的杀菌作用 ,乙醇提取物的 MBC 为 100 mg/ ml 。结论 五味子的乙醇提取物具有明显的抑菌和杀菌作用。 关键词 五味子，提取物，副溶血性弧菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，抗菌活性 4 Schisandra and ot
4、her antibacterial activity of extracts Abstract: Purpose Schisandra extract of antibacterial activity, Provide the basis for its reasonable development. Method Ethanol, methanol and water 3 to stir the solvent extraction of Schisandra, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, and Shigella bac
5、teria as tested by drilling method to measure the minimum inhibitory concentration (MIC). Results 3 Schisandra extract on Staphylococcus aureus significantly inhibited, in which the inhibitory effect of ethanol extract of the most significant, followed by the methanol extract, and finally the water
6、extract, MIC, respectively 25,50 and 100 mg / ml. At the same time, Low concentration of ethanol extract of inhibition was not obvious, the concentration of 62. 5 mg / ml of bacterial growth was completely inhibited, but no significant bactericidal effect, ethanol extract of the MBC was 125 mg / ml.
7、 Conclusion The ethanol extract of Schisandra has obvious inhibitory and bactericidal effects. Key words: Schisandra extract, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, Shigella, antimicrobial activity 5 1 前言 1.1 概述 五味子是 木兰科多年生落叶木质藤本植物 , 其果实入药 , 嫩叶可做茶叶等保健用品 , 因其果实甘、酸、辛、苦、咸五味俱全而得名。是著名的滋补药 , 其药用部
8、位为干燥成熟果实 【 1-2】 。 具有敛肺、滋肾、生津、止泻、固精之功效 , 主治嗑喘、盗汗、久泻、神经衰弱 , 还可制作果冻 , 具有美容、养颜的作用 , 入药以产于东北的北五味子为佳。 在日本和中国药典中，五味 子是热门的专论题材。早在两千多年前，王宫贵族和中药名师已普遍采用这种传统沿用的强身妙品。五味子，是一种具有辛、甘、酸、苦、咸五种药性的果实，在一般只带有一、两种药味的中药材当中，实属独特。这种五味俱全、五行相生的果实，能对人体五脏 心、肝、脾、肺及肾发挥平衡作用。 1.2 国内外研究形式 目前国内外有关五味子化学成分的报道有很多， 五味子及其部分亲缘种普遍含有木脂素， 从南五味子
9、和北五味子中提取的联苯环辛烯类，含有五味子甲乙素乙醇及甲、乙、丙、丁、戊酯； 此外还含有挥发油、有机酸、脂肪油及三萜类化合物等成分。 具收敛固涩、益气生津、敛肺滋肾、保肝之功效， 亦含有多种天然抑菌成分，能抑制多种致病菌。但其抑菌物质的含 量、成分及其抑菌效果受提取条件如提取温度、提取时间和提取剂 pH 值等影响。因而， 对其提取条件的研究十分重要。本实验以五味子提取物对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌等 3种细菌在不同条件下的抑菌效为指标，以得到抑菌效果较好的五味子提取物。旨在探索颇具开发潜力抗感染的中草药。 五味子及其部分亲缘种普遍含有木脂素， 从南五味子和北五味子中提取的联苯环辛烯
10、类，含有五味子甲乙素乙醇及甲、乙、丙、戊酯； 此外 还含有有机酸、挥发油、脂肪油及三萜类化合物等成分。具敛肺滋肾、益气生津、收敛固涩、保肝之功效， 亦含有多种天然抑菌成分，能抑制多种致病菌。但其抑菌物质的含量、成分及其抑菌效果受提取条件如提取温度、提取时间和提取剂 pH 值等影响。有强心、降压和兴奋呼吸、兴奋子宫的作用 , 并能降低血清转酶。对绿浓杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、人型结核杆菌有抑制作用。因而， 对其提取条件的研究就变得十分重要。本实验以五味子提取物对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌等 3种细菌在不同条件下的抑菌效为指标，以得到抑菌效 果较好的五味子提取物。旨在探
11、索颇具开发潜力抗感染的中草药。五味子对大脑皮层的兴奋过程和抑制过程都有影响 , 可以提高大脑皮层的调节作用 , 提高智力活动能力 , 促进新陈代谢 , 提高机体防御力。 王柯 4 等报道 , 用双波长薄层扫描仪定量测得 , 云南大理产成熟红花五味子果实中 7 种6 木脂素成分平均含量最高。从红花五味子中分离得到五味子丙素、甲素及五味子酚 , 异梗五味子中分得五味子酯乙、酚、甲素等。 五味子对大脑皮层的兴奋过程和抑制过程都有影响 , 可以提高大脑皮层的调节作用 , 提 高智力活动能力 , 促进新陈代谢 , 提 高机体防御力。有强心、降压和兴奋呼吸、兴奋子宫的作用 , 并能降低血清转酶。对绿浓杆菌
12、、痢疾杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、人型结核杆菌有抑制作用。 因为其具有较强的药用价值。五味子具有多种作用。包括保肝及再生肝脏组织、消炎作用、保护及增强心脏机能、延缓老化过程、滋补和增强肾脏机能、增进智能健全、增强体能耐力等功能。五味子对大脑皮层的兴奋过程和抑制过程都有影响 , 可以提高大脑皮层的调节作用 , 提高智力活动能力 , 促进新陈代谢 , 提高机体防御力。有强心、降压和兴奋呼吸、兴奋子宫的作用 , 并能降低血清转酶。对绿浓杆 菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、人型结核杆菌有抑制作用。 五味子能促进肝脏的解毒过程、保护肝脏免受毒害，并能再生因滥用酒精、药物或肝炎而受损的肝脏组织
13、。五味子能降低不断升高的转胺酶 丙胺酸转胺酶（ SGPT/ALT-20天内降低75%）和甲型胎儿球蛋白（ AFP-最广泛用于生化血液检验以检测肝癌）水平，比起水飞蓟素其效用更安全。 1.3 本文研究意义与内容 在不断研究如何有效利用五味子的同时 ,也对它的利用价值进行了深入的研究。本文将大肠杆菌、金黄色葡萄球副溶血性弧菌作为供试菌种，研究了五味子醇提法、水 提法、系统溶液法的不同提取工艺以及不同提取工艺提取出取物对供试菌抑菌活性大小。通过对比发现五味子乙醇提取物的抑菌活性最强，可以用来测定其最低抑菌浓度。实进行了乙醇最佳工艺的研究和 PH值、光照时间、温度等因素对五味子乙醇提取物稳定性的研究。
14、结果表明 :五味子提 物对三种供试菌种都有一定的抑菌活性，且抑菌活性大小为：大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 副溶血性弧菌。然本实验只是研究了五味子不同提取物抑菌活性的大小，却没有具体区分提取物的各种花学分。但还是说明子经不同提取工艺提取出的提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和副溶血 性弧菌都具有一定的抑菌活性。通过实验五味子具有较强的抑菌活性，可以为以后进一步研究其他活性打下基础。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 五味子、金银花和仙人掌于 2010 年 9 月份在舟山市定海区芝林大药房购买。 7 2.2 实验菌种 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 副溶血性
15、弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 大肠杆菌（ Escherichia coli）以上三种菌种均为舟山市定海区疾控中心提供。 2.3 主要试剂 试剂 （规格） 盐酸（分析纯 AR） 、 Nacl（分析纯 AR）、 NaoH（分析纯 AR）、 50%甲醇（分析纯 AR） 四氯化碳（分析纯 AR）、 乙醇 95%（分析纯 AR）均为国药集团化学试剂有限公司生产 营养肉汤和营养琼脂培养基 杭州天和微生物试剂有限公司 2.4 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 循环水式多用真空泵 SHB-IIIA 型 河南省太康科教器材厂 旋转蒸发仪 RE-2000 型 上海亚荣生化仪器厂 真空泵
16、SHB-IIIA 型 上海亚荣生化仪器厂 移液枪 京明力普瑞移液器专业制造厂 立 式自动电热压力蒸汽灭菌器 LDZX-40BI 型 上海申安医疗器械厂 超声波清洗器 KQ-500E 型 昆山市超声仪器有限公司 智能恒温恒湿箱 HWS 型 宁波东南仪器有限公司 高速药物粉碎机 WK-800A 型 青州市精诚机械有限公司 万用电炉 浙江上虞市通州实验仪 器厂 培养皿（ 内径 90.0 0.1mm，高 15 16 mm） 2.5 培养基及缓冲液配制 营养肉汤培养液 2.5g 牛肉膏 2.5g 氯化钠 500mL 水混合加热后，调节 pH至 7.0 7.2，三角瓶分装， 121灭菌 20min。 营养
17、琼脂培养基 2.5g 牛肉膏 2.5g 氯化钠 500mL 水混加热后，调节 pH 至 7.0 7.2，加热溶解，用三角瓶分装， 121灭菌 20min。 生理盐水 4.5g 氯化钠 500mL 蒸馏水，溶解后在 121灭菌 20min、。 3 实验方法 8 3.1 提取 将得 到的五味子 、金银花和仙人掌 晒干，把干燥器设置成 50 在里面保存 4 小时，取出后用告诉药物粉碎机粉碎至 60 目。 称取五味子、金银花和仙人掌粉末每份 5g， 装入容器中 分别 加入 乙醇、 50%甲醇和水在 70时 600W 微波 提取 30min， 滤出提取液 ，旋转蒸发后得提取物 ，用无菌水配制成 0.6g
18、/ml，做为原液， 置 4保存备用。 3.2 检测平板的制备 将配好的营养琼脂冷却至 50左右，用吸管准确量取 20mL 该培养基，加入水平放置的培养皿内，凝固后等培养皿中水份挥发后，取 0.5mL 的指示菌菌悬液在平板上，用无菌圈涂布均匀，涂 布后以平板无可见水滴为准。此时的平板立刻进行抑菌试验。 3.3 试验菌种的活化 将斜面培养基上的副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 接种到 250mL 三角瓶的营养肉汤培养基中，在振荡培养箱中以 125r/min 的转速和 37的温度下活化培养 24h 后，移出1mL 菌液在相同条件下重复培养相同时间，得到初始菌液。 3.4 指示菌菌悬液的制备
19、将 副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 菌种接入三角瓶中，瓶中预先放入少量玻璃珠和经过灭菌的生理盐水。用力振荡后，经过放有杀菌脱脂棉的漏斗，倒入三角瓶，过滤菌液 后，得到了含菌的悬浮液。 用无菌生理盐水将副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 稀释成浓度都在 2 102 4 102cfu/mL。 3.5 抑菌试验 3.5.1 琼脂平板孔穴法（ K-B法） 抑菌圈直径作为药物敏感初筛 。 将 副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 等 3种菌悬液各 5 ml分别倒入 150 ml融化 且 冷却至 50 55 的 营养琼脂 培养基中充分摇匀，迅速分装于培养皿中，培养基厚约 5 mm，待凝
20、固后，琼脂平板上打 4个对称且直径为 7mm的小孔，在小孔内注入 0.2 ml各种提取液，每个菌种做 3个平行样本。置于 37 恒温培箱中培养 24 h，观察结果，测量抑菌圈直径（以完全不生长菌作为测量标准），以各产物对测试菌 3次平均值为抑菌圈直径，小于 8 mm或无抑菌圈为阴性 ， 菌圈大于 10 mm为有效 。 3.5.2 最低抑菌浓度（ MIC）测定 采用试管倍比稀释法。取无菌试管 12支，在第 1、 2支试管中 加入药液 0.5 ml， 从 第 2支到9 第 10支试管均 加人营养肉汤 0.5 ml，用 1 ml灭菌 吸管从第 2支试管 开始倍比稀释药液至第 10支试管 ， 然 后从
21、第 10支试管 中 用 5ml灭菌吸管吸走 0.5ml。 往 第 11支试管 加营养肉汤 1 ml， 在前 11支试管 中分别加入 营养肉汤 1.0 ml， 在 第 12支试管中 加 入 营养肉汤 2.0 ml；第 1至 11支试 管各加菌悬液 0.5 ml。第 11支试管 不加药液为对照，第 12支试 管只加 2.0 ml营养肉汤为对照。充分混匀后 放置 于 37.5 恒温箱培养 20 h。 MIC 判断 的 标准： 37.5 培养 20 h 后首先观察 到第 11 支试管 长菌呈浑浊状，而 第 12 支试管 不长菌、呈透明状，再观察其他试管的浑浊情况，以判断不同浓度药液的抑菌作用，如如试管
22、内澄清透明，证明无菌生长，用 “ -” 表示 ， 试管内呈浑浊，证明有细菌生长，用 “ +”表示 。 以肉眼观不浑浊试管的 最低药物浓度作为该药的 MIC。 3.6 乙醇提取因素水平表 根据已有的资料，本实验选用剂料比、提取时间、提取温度为考察因素，以五味子有效成分得率作为考察指标，运用 L9(34)正交试验设计法进行试验。 表 1 乙醇提取因素水平表 因素 水平 1 2 3 剂料比 (ml.g-1) 10 15 20 提取时间（ h） 1 1.5 2 提取温度 ( ) 60 70 80 3.7 五味子提取物抑菌性的影响因素实验 3.7.1 pH 值对五味子提取物的抑菌活性的影响 取乙醇最佳提
23、取工艺下的部分溶液，用 pH 值的 不同缓冲液进行稀释，各溶液的 pH 值分别 1.0、 3.0、 5.0、 7.0、 9.0 和 11.0，并用这些不同 pH 值的缓冲溶液和原液为对照，以金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 和副溶血性弧菌为指示菌，测定其抑菌效力。 3.7.2 紫外光对五味子提取物的抑菌活性的影响 取乙醇最佳提取工艺下的部分溶液，将其置于紫外灯下分别照射 5、 10、 15、 20、 25min后，以原液作为对照，以金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 和副溶血性弧菌为指示菌，测定其抑菌效力。 10 3.7.3 五味子提取物抑菌性的热稳定性实验 取乙醇最佳提取工艺下的部分溶液分 别置于 30、
24、 60、 90水浴和 121湿热条件下各自处理 30min，对照样则置于 25常温下。以金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 和副溶血性弧菌为指示菌，用抑菌圈直径法来比较各温度下溶液的抑菌效力，实验重复 3 次。 4 实验结果与讨论 4.1 不同溶剂提取工艺的优化 不同的溶剂可以提取出不同的五味子抑菌活性物质，其抑菌效果也有很大的差别。表 2、 3、4主要是对五味子、银花、仙人掌的不同溶剂提取物进行抑菌性的研究，确定抑菌性最佳的药材与溶剂。从表 2可以得出，五味子的甲醇 0%乙醇的提取物对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大 肠杆菌都有抑菌活性。而氯仿：甲醇提取物只对副溶血性弧金黄色葡萄球菌有抑菌效果，对大
25、肠杆菌无抑菌效果。其他的溶剂提取物对三种细菌都没有显示出抑菌效果。从表知，金银花中只有乙醇的提取物对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有一定的抑菌效果，其他提取物有抑菌效果。从表 4可以看出，仙人掌的乙醇和 50%乙醇的提取物对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌都有活性。而氯仿：甲醇提取物只对副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌有抑菌效果，对大肠杆菌无抑菌效果。其他的溶剂物对三种细菌都没有显示出抑菌效果。 从上述结果中，我们可以得 知五味子提取物的抑菌活性 仙人掌 金银花提取物的抑菌活性。而甲醇和 50%乙醇的抑菌效果相似，因此在下面的实验中我们将对甲醇和 50%乙醇的最佳提取工艺进行优化，从而确定其最佳的提取工艺 下列 3张表是五味子、金银花和仙人掌使用 50%乙醇、 50%甲醇和水分别提取，对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 和副溶血性弧菌的抑菌圈大小。 表 2 五味子几种溶剂提取物的抑菌圈直径 / 溶液 副溶血性弧菌 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 50%乙醇 13.2 14.5 15.6 水 0 0 0 50%甲醇 10.2 12.5 13.1 表 3 金银花几种溶剂提取物的抑菌圈直径 / 溶液 副溶血性弧菌 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌
