1、 本科毕业论文 （ 20 届） 蜈蚣藻中多酚的提取及抗氧化研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 中文 摘要 . 3 英文摘要 . 4 1 前言 . 5 2 实验材料、主要仪器与试剂 . 6 2.1 材料与试剂 . 6 2.2 主要仪器 . 6 3 实验方法 . 7 3.1 红蜈蚣藻多酚的提取 . 7 3.2 红蜈蚣藻多酚含量的测定 . 7 3.3 红蜈蚣藻多酚抗氧化活性的测定 . 7 3.3.1 清除 DPPH 自由基能力的测定 (DPPH 法 ) . 7 3.3.2 清除羟自由基能力的测定 . 8 3.3.3 铁还原力能力的测定 . 8 4
2、实验结果与讨论 . 8 4.1 红蜈蚣藻多酚含量 . 8 4.2 红蜈蚣藻多酚的抗氧化活性 . 9 4.2.1 清除 DPPH 自由基能力的测定 . 9 4.2.2 清除羟自由基能力的测定 . 9 4.2.3 铁还原力能力的测定 . 10 4.3 讨论 . 10 5 结论 . 11 参考文献 . 11 致 谢 . 13 3 蜈蚣藻中多酚的提取及其抗氧化研究 摘要 目的：研究蜈蚣藻中多酚的体外抗氧化能力。方法：采用 工业甲醇浸泡提取，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取蜈蚣藻多酚，分别利用三种体系，通过对二苯基苦味肼基自由基 (DPPH)、羟自由基 (OH)和 铁还原力能力 来评价其抗氧化活性。
3、采 用 FolinCiocalteau 试剂测定总多酚含量。 结果：蜈蚣藻多酚对 DPPH 的清除率 随着多酚浓度的增加清除能力增强 ：石油醚相 乙酸乙酯相 正丁醇相 粗提物；对 羟自由基的清除率： 石油醚相 粗提物 乙酸乙酯相 正丁醇相； Fe 还原力的大小： 石油醚相 乙酸乙酯相 正丁醇相 粗提物，即石油醚相抗氧化活性最好。 当 5 mg/ml 浓度时，粗提物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相萃取物对 DPPH的清除率分别为 50.51%、 83.58%、 64.82%、 55.70%， 对 OH 的清除率分别 75.95%、 93.99%、51.86%、 30.94%，且其铁还原力测定为
4、0.1425、 0.6204、 0.3497、 0.1725， 且 总酚含量与蜈蚣藻各提取物的抗氧化活性 之间具有一定的相关性。 结论： 蜈蚣藻的石油醚相在清除羟自由基和 DPPH 自由基方面表现出 较强的抗氧化活性。 这些数据表明 :甲醇提取物及各相萃取物较高的酚含量可使其作为抗氧化补充剂。 关键词 多酚；抗氧化活性； DPPH； OH； Fe还原力 4 Evaluation of Antioxidant Activity of Polyphenol Obtained from Grateloupia filicina Abstract Objective: To investigate t
5、he antioxidation capacity of the polyphenol in vitro extracted from Grateloupia filicina. Methods: The antioxidant activities of methanol (MC) extracts and fractions （ petroleum ether、 ethyl acetate、 n-butyl alcohol and water fraction） from Grateloupia filicina were evaluated through DPPH/hydroxyl r
6、adical-scavenging activity and reducing power. Total phenolic content was investigated using FolinCiocalteau reagent. Result: DPPH radical-scavenging activity of polyphenol of Grateloupia filicina were were listed in a decreasing order as follows: petroleum ether extract ethyl acetate extract n-buty
7、l alcohol extract crude extract; and OH radical-scaveng activity: petroleum ether extract crude extract ethyl acetate extract n-butyl alcohol extract; and Fe Reducing Power: petroleum ether extract ethyl acetate extract n-butyl alcohol extract crude extract, so petroleum ether extract has the highes
8、t antioxidative activity. At the econcentration of 5mg/ml, DPPH radical-scavenging activities of crude extract, petroleum ether extract, ethyl acetate extract and n-butyl alcohol extract were as follows: 50.51%、 83.58%、 64.82%、 55.70%; and OH radical-scaveng activities were 75.95%、 93.99%、51.86%、 30
9、.94%; and the Reducing Power are 0.1425、 0.6204、 0.3497、 0.1725. Antioxidant activities of crude extract and fractions showed an increase with increasing concentration indicating the dose dependency of these properties. Conclusion: Polyphenol of Grateloupia filicina had strong antioxidation activity
10、, which can scaveng DPPH and hydroxyl free radical. These data suggest that the methanolic extracts and fractions may be useful as antioxidant supplements due to its high phenolic content. Key w ords Grateloupia filicina; Polyphenol; Anitioxidation activity 5 1 前言 1.1 蜈 蚣藻 海藻生活在特殊生态环境（高盐度，高压，低氧，避光）下
11、，普遍含有特殊功能的生物活性物质如酚类、吲哚类、萜类等化合物，是海洋天然药物的重要来源。蜈蚣藻 属于红藻门、真红藻纲、隐丝藻目、海膜科、蜈蚣藻属 1。 藻体紫红色，粘滑，丛生， 线形或略扁压，单一 及顶，主干明显，规则或不规则的羽状分枝，生长在低潮带附近岩石和贻贝养殖架上。蜈蚣藻为世界性的暖温带型海藻，产于我国南北各地，在我国的青岛、大连等沿海地区有着广泛的分布。多可食用或作制胶原料，广东潮阳等地居民常用作驱蛔虫药 2。 中国蜈蚣藻属共报道 32 种 3。 该属海藻种类的外部形态各种各样，变异很大，如带形蜈蚣藻为黏滑的叶片状，而繁枝蜈蚣藻为硬的革质的线形，同一种类的形态也因生态环境、地域的不同
12、变化很大 4。 1.2 多酚 多酚是植物的茎、叶、花等部分所含有的色素、苦味和涩味成分的总称。它是通过光 合作用合成的，种类多，其中还有一部分不为人所了解。虽然多酚类物质不是人体每日所必需的营养素，但现在的医学研究中发现这类物质却具有超强的抗氧化能力。其主要包括类黄酮化合物和酚酸类化合物，具有很强的消除有害 自由基 能力， 抗衰老 、 抗辐射 、抗菌、杀菌作用，以及对癌细胞和艾滋病病毒的抑制作用 5。多酚作为一种强抗氧化剂、自由基清除剂，可以使机体内源性的抗氧化酶活性增加，或通过膳食补充外源抗氧化剂起到预防肿瘤等疾病发生的作用。但它的抗氧化机制比较复杂，一般认为：清除自由基、酚羟基的离解，络合
13、有催化作用的金属离子，吸收紫外光是起主要作用的因素。 1.3 自由基 生物机体内绝大多数分子是由氢离子和其它基团组成的 , 常常可以发生其 它基团与氢离子的解离 , 形成带一个电子的其它基团与氢离子 , 称为氧自由基。常见的有 : 氧离子自由基、羟自由基、脂质自由基、过氧化氢自由基、氢自由基、有机自由基、烷氧基自由基、有机过氧自由基、氧化脂质自由基等。自由基极其不稳定 , 容易与其它物质反应生成新的自由基 , 因而往往产生连锁反应。自由基连锁反应一开始 , 所生成的新自由基就进一步与基质反应 , 从而导致基质的大量消耗 , 及多种自由基产物的生成。机体新陈代谢产生自由基 , 可以造成机体的损伤
14、 , 致使疾病的发生。正常情况下 , 机体有完善的自由基清除系统 , 控制着 自由基的产生与清除。随着机体的老化 , 自由基清除系统逐渐功能减弱 , 造成自由基大量聚集 , 最终造成不可逆转的损伤 , 生命从而走向凋亡。随着年龄增长 , 机体内自由基水平呈增长趋势 , 同时自由基清除机制却逐步退化 , 结果造成体内自由基大量积聚。所以自由基对机体的健康危害日益加重 , 引发了多种生理功能的障碍 , 促进多种老年疾病的发生发展 ,导致机体的衰老 , 直至死亡。在整个衰老过程中 , 自由基引起大量细胞衰老、死亡 , 近年来有大量资料表明这些细胞的衰老、死亡 , 许多属于自由基引发的细胞凋亡 6。
15、6 1.4 抗氧 化剂 抗氧化剂是一类能帮助捕获 且 中和自由基，从而 去 除自由基对人体损害的一类物质，不仅可以能防止油脂和食品氧化延长保质期，且还有许多防病保健功能 7。因此，抗氧化剂广泛用于食品工业，需求量逐年 不断 增加。由于合成抗氧化剂 像 植物酸（ BHA）、 2， 6- 二叔丁基对甲酚（ BHT）和特丁基对苯二酚（ TBHQ）等 其的 毒性问题 8，以及人们越来越追求绿色环保消费， 故 开发安全、高效的天然抗氧化剂 已 成为食品工业的一项重大课题。海藻是人类在食品、工业 、 药用 等 方面的重要资源 9。近年来，海藻中次生代谢物质，如萜类、甾醇类、大环内酯类和酚类等已成为研究的热
16、点，特别是多酚物质因其所具有的抗氧化特性而备受瞩目10-12。 因此，本论文以蜈蚣藻多酚为研究对象，对其提取工艺和抗氧化活性进行评价，为其后续开发提供参考依据。 2 实验材料、试剂与主要仪器 2.1 材料与试剂 蜈蚣藻于 2009 年 12 月购于江苏昆山一弘藻业有限公司，由浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定蜈蚣藻（ Grateloupia filicina）。 工业甲醇； Folin-Ciocalteu 试剂 ； 碳酸钠；没食子酸；甲醇；石油醚；乙酸乙酯；正丁醇；二苯代苦味酰基自由基 (DPPH)；邻二氮菲；磷酸二氢钠；磷酸氢二钠；硫酸亚铁； 双氧水（ 30%）；铁氰化钾； 氯化铁；三氯乙酸；（以上
17、试剂除工业甲醇外，均为分析纯，并购买于国药集团化学试剂有限公司）。 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂 家 紫外可见分光光度计 U-2800 日本日立紫外可见分光光度计有限公司 旋转蒸发仪 RE-2000 上海亚荣生化仪器厂 循环水式多用真空泵 SHB- A 河南省太康科教器材厂 超声波清洗器 SK5200H 上海科导超声仪器有限公司 电热恒温水浴锅 HWS12 型 上海医学科仪器有限公司 高 速万能粉碎机 FW100 天津市泰斯特仪器有限公司 药物电子天平 FA1004N 上海民桥精密科学仪器有限公司 超纯水器 UPWS-I-20T 杭州永达洁净水科技有限公司 电子天平（ e=10d） B
18、SA323S 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 冷却水循环装置 EYELA CA-1111 上海爱朗仪器有限公司 7 3 实验方法 3.1 蜈蚣藻多酚的提取 提取 ：取粉碎的蜈蚣藻粉末用 3 倍量工业甲醇浸泡三次 (每次 72 小时 )，合并浸提液。减压浓缩，用甲醇脱盐三次，抽滤，合并三次滤液，减压浓缩后得浸膏，备用。 萃取 ：浸膏加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取三次，每次萃取溶剂与水溶液体积比 1:1，分别合并石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层，减压浓缩，得萃取物。 操作流程： 样品处理 超声波 抽滤 减压浓缩 脱盐 减压浓缩 粗浸膏 浓缩物用水溶解 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取
19、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相萃取物减压浓缩 浸膏。 3.2 蜈蚣藻多酚含量的测定 多酚含量测定 13：以 AOAC(1970)的标准分析方法测定，即用 Folim-Denis 试剂在碱性条件下与多酚类物质形成蓝色复合物后，用紫外 -可见分光 光度计作比色分析 14。 3.2.1 没食子酸标准曲线的 绘制 取浓度为 0.05 mg/mL 的没食子酸溶液（ 称取 0.05g 没食子酸，用蒸馏水定容于 1000 mL容量瓶中） 0.1 mL、 0.3 mL、 0.5 mL、 0.7 mL、 0.9 mL在 10 mL 分别加入试管内，然后加入0.1mL 福林酚试剂，放置 3 min 后加入 2%的
20、 Na2CO3 2 mL，转移至 5ml 容量瓶中，用蒸馏水定容到 5 mL，在 25 下反应 30 min 后，于 760 nm 测其吸光度，每个浓度平行测定 3 次，分别记录吸光值，以平均值做标准曲线。 调零 ：加 0.1ml 福林酚试剂， 2%碳酸钠溶液 2ml，后用蒸馏水定容至 5ml。 3.2.2 蜈蚣藻多酚含量测定 取蜈蚣藻粗提物、 石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相萃取物各 10mg，各用 1ml 甲醇溶解，配制成 10 mg/mL 的样品溶液。取样品溶液 0.5 mL，置于 10 mL 的试管内，然后加入 0.1 mL福林酚试剂， 3 min 后加入 2碳酸钠溶液 2 mL，再用蒸
21、馏水定容到 5 mL， 25 下反应 30 min，在 760 nm 处测定吸光度，平行测 3 次。 调零：加 0.1ml 福林酚试剂， 2%碳酸钠溶液 2ml，后用蒸馏水定容至 5ml。 3.3 蜈蚣藻多酚抗氧化活性的测定 3.3.1 清除 DPPH 自由基能力的测定（ DPPH 法） 15 分别取 蜈蚣藻 取 粗提物和各相萃取物 3ml 加 3mL DPPH（甲醇溶液， 0.2 mmol/L， 该溶液需现用现配 ），混合均匀后室温暗处放置 30 min，于 517 nm 处测定吸光度 Asample；分别取 粗提物和各相萃取物 3ml 加入 3 mL 甲醇溶液于 517 nm 处测定吸光度
22、 Asample blank； 3 mL DPPH 中加入 3 mL 甲醇于 517 nm 处测定吸光度 Acontrol； 6 ml 甲醇于 517 nm 处测定吸光度 Ablank。平行测定三次，计算平均值。 蜈蚣藻多酚样品对 DPPH 的清除率按下式计算 16 ，用 Ablank 管调零。 清除率 (%)=1(AsampleAsampleblank)/(AcontrolAblank)100% 8 3.3.2 清除羟自由基能力的测定 17 取浓度为 0.75mmol/ L 邻二氮菲 1 mL 于试管中，加入 0.2mol/L 磷酸缓冲溶液（ PBS，pH 值为 7.40） 2 mL，充分混
23、匀后，加入浓度为 0.75 mmol/ L 的硫酸亚铁 1 mL，混匀，加质量分 数为 0.1% 的 H2O2 1 mL，再加 1 mL 蒸馏水至 6 mL，于 37 水浴 60 min，于 536 nm 处测其吸光度，为 A536损伤；用 1 mL 蒸馏水代替 1 mL H2O2，为 A536空白；分别用蜈蚣藻 粗提物和各相萃取物 代替 1 mL 的蒸馏水，为 A536加样。蜈蚣藻多酚样品对羟自由基的清除率 (E)按下式计算 16，用 甲醇调零。 E(%)=(A536加样 -A536损伤 )/(A536空白 -A536损伤 )100% 3.3.3 Fe 还原力的测定 18 分别取 蜈蚣藻 取
24、 粗提物和各相萃取物 1ml，加 0.2mol/L PBS（ PH=6.6） 1ml，再加 1%铁氰化钾 1ml，置于 50C 水浴中 20min，加入 10%三氯乙酸（ TCA） 1ml 混合后，以 8000r/min 离心 5min，取其 1ml 上清液，加蒸馏水 1ml，再加入 0.1%FeCl3 0.2ml，混合均匀静置 10min，于 700nm 下测其吸光度。调零：甲醇 1ml+0.2mol/L PBS（ PH=6.6） 1ml+1%铁氰化钾 1ml。 4 实验结果与讨论 4.1 蜈蚣藻多酚的含量 4.1.1 没食子酸标准曲线 00.10.20.30.40.50.60.70.80
25、0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.01图1 没食子酸标准曲线y = 7 4 . 1 2 7 x + 0 . 0 6 8 9R 2 = 0 . 9 9 6 0浓度（ mg/ml）吸光度（Abs）以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程 y=74.127x + 0.0689，R2 =0.9960，结果表明没食子酸浓度在 0.0010.01mg/ml 范围内与其吸光度值呈现良好的线性关系。 4.1.2 蜈蚣藻取 粗提物和各相萃取物多酚的含量 19 蜈蚣藻 取 粗提物和各相萃取物 测得的吸光度值与没食子
26、酸标准曲线比较，总酚含量（ GAE）表示为每克样品干重相当于没食子酸的量（ GAE： mg 没食子酸 /g 样品干重 )。 表一 蜈蚣藻 取 粗提物和各相萃取物多酚的含量 各相 浓度 C(mg/mL) 各相吸光度 A760 多酚含量（ mg没食子酸 /g各相） 粗提物 1 0.2530 2.484 9 石油醚相 1 0.7905 9.730 乙酸乙酯相 1 0.8341 10.32 正丁醇相 1 0.6226 7.470 表一可看出蜈蚣藻的粗提物和各相萃取物均含有一定量的多酚成分，其中乙酸乙酯相萃取物酚类含量最高（ 10.32 mg/g），粗提物分类含量最低（ 2.484 mg/g）。 4.2
27、 蜈蚣藻多酚的抗氧化活性 4.2.1 清 除 DPPH 自由基能力的测定 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的以氮为中心的自由基，其结构中有 1 个孤对电子，其溶液在 517 nm处具有紫红色特征吸收峰。当存在自由基清除剂时，与其单电子配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成量效关系的，因此可用于检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。 0204060801001200 2 4 6 8 10 12图2 粗提物和各相对 D P P H 的清除率 浓度（ mg/ml）清除率（%）粗提物石油醚相乙酸乙酯相正丁醇相从图二可得出 各相萃取物和粗提
28、物对 DPPH 的清除随浓度的增大清除率增大，且石油醚相 乙酸乙酯相 正丁醇相 粗提物。石油醚相对 DPPH 的清除在 10mg/ml 时甚至达到 100%。此外，在这个实验中所做的 空白实验是在不加样品的情况下，用测定样品相同的方法、步骤进行定量分析，把所得结果作为空白值，从样品的分析结果中扣除，从而消除由于试剂不纯或试剂干扰等所造成的系统误差，进而减小实验误差。 4.2.2 清除羟自由基能力的测定 邻二氮菲 -Fe2+是常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。 H2 O2 /Fe2+体系 通过 Fenton反应产生羟自由基，邻二氮菲 -Fe2+水溶液可被羟自由基
29、氧化为邻二氮菲 -Fe3+，从而使邻二氮菲 -Fe2+在 536nm处的最大吸收峰消失。当 加入还原性物质后，它可以与羟自由基反应，从而使 Fe2+免遭氧化，吸光度比原来增大，因此可用于检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。 10 0204060801001200 1 2 3 4 5 6图3 粗提取和各相对羟自由基的清除率浓度（ mg/ml）清除率（%）粗提物石油醚相乙酸乙酯相正丁醇相由图三可知对羟自由基的清除： 石油醚相 粗提物 乙酸乙酯相 正丁醇相。而其中石油醚相对羟自由基的清除率增幅最大，且石油醚相对羟自 由基的清除在 5g/ml 时甚至达到 100%。正丁醇相对羟自由基的
30、清除随浓度（ 1-5mg/nl）的增大其清除率增幅很小。 4.2.3 铁还原力能力的测定 铁还原力的测定通常用来评价天然抗氧化剂的供电子能力 ， 抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子而使自由基变为稳定的分子 ， 从而失去活性。 Fe3+溶液呈淡黄色 ， 当 Fe3+被样品中的抗氧化剂还原为 Fe2+时 ， 溶液的颜色就变为蓝色 ,蓝色越深表示样品还原能力越强。通过测定反应混合物 700nm处吸光度来评价 化合物的还原力，吸光度越大，还原力越强。 00.10.20.30. 40.50.60.70.80.910 5 10 15 20 25 30图4 粗提物和各相 Fe 还原力的测定浓度（ mg/ml）吸光度（Abs）粗提物石油醚相乙酸乙酯相正丁醇相由图四可得出 Fe 还原力的大小：石油醚相 乙酸乙酯相 正丁醇相 粗提物，其中正丁醇相和粗提物的对 Fe 还原力的大小和增幅都很相近，与石油醚相和乙酸乙酯相相差甚远。 4.3 讨论 （ 1） 比较三种不同抗氧化方法得出的结果：对 DPPH 的清除（ 1-10mg/ml）：石油醚相 乙酸乙酯相 正丁醇相 粗提物；对 羟自由基的清除（ 1-5mg/ml）： 石油醚相 粗提物 乙酸乙酯相 正丁醇相； Fe 还 原力的大小（ 5-25mg/ml）： 石油醚相 乙酸乙酯相 正丁醇相 粗提物。可
