1、 本科毕业论文 （ 20 届） 鱿鱼边角料抗氧化酶解产物的制备及组成分析 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 2 - 目 录 摘要 . 错误 !未定义书签。 关键词 . 错误 !未定义书签。 ABSTRACT . 错误 !未定义书签。 1、前言 . 5 2、材料与方法 . 6 2.1 材料 . 6 2.2 主要设备与仪器 . 7 2.3 试验方法 . 7 2.3.1 酶解制备抗氧化肽工艺路线 . 7 2.3.2 木瓜蛋白酶酶解条件的优化 8 . 7 2.3.3 鱿鱼蛋白酶解物的分离、纯化 9 . 8 2.4 抗氧化试验 . 8 2.4.1 DPPH1
2、0 . 8 2.4.2 还原力 11 . 8 2.4.3 清除羟自由基能力的测定 12 . 8 3、结果与讨论 . 8 3.1 单因素实验 . 8 3.1.1 酶解时间对鱿鱼蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 . 8 3.1.2 酶用量对鱿鱼蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 . 9 3.1.3 酶解温度对鱿鱼蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 . 9 3.1.4 酶解液 pH 值对鱿鱼蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 . 10 3.2 正交试验及数据处理 . 10 3.3 鱿鱼蛋白抗氧化肽的分离 . 11 3.4 抗氧化能力比较 . 11 4、结论 . 12 5、本实验成果前景 .
3、 12 参考 文献 . 错误 !未定义书签。 致 谢 . 错误 !未定义书签。 - 3 - 摘 要 目的：研究鱿鱼蛋白酶解产物的制备工艺及抗氧化活性。方法：以 DPPH 清除率为指标，通过单因素实验和正交试验确定木瓜蛋白酶的最佳酶解条件，用 Sephadex G-25 分离、提纯，检测各组分的抗氧化活性。结果：木瓜蛋白酶酶解鱿鱼蛋白制备抗氧化肽的最佳酶解条件为：温度 50C 、 pH 7.0、酶解时间 3 h、加酶量 1.0%；酶解产物的抗氧化活性大于酶解之前粗蛋白的抗氧化活性；酶解产物经 Sephadex G-25 纯化之后，得到组分 F1-F3，其中，组分 F1 抗氧化活性最高，在 5mg
4、/mL时 DPPH 清除率、还原力、羟自由基清除率分别为 63.85%、 0.236、 18.13%，其相对分子质量集中在 307 左右。结论：酶解并经过 Sephadex G-25 纯化制备的鱿鱼蛋白多肽具有较强的抗氧化能力。 关键词 鱿鱼 抗氧化肽 木瓜蛋白酶 酶解 - 4 - Abstract: Objective: Antioxidant properties of hydrolysate from Loligo chinensis by papain were studied. Method: The optimal conditions of papain hydrolysis w
5、ere obtained by single-factor experiments and orthogonal test w ith the DPPH scavenging ratio as index. The hydrolysate was isolated w ith a Sephadex G-25 column. Also, the antioxidant properties of crude protein, crude and fractions of enzymatic hydrolysate were measured. Result: The hydrolysate w
6、ith the DPPH scavenging ratio being 63.85%, w as gained under the condition of temperature 50 C, pH 7.0, enzymatic hydrolysis time 3 h, amount of enzyme 1.0%; The fraction F1 w ith the highest antioxidation activity was collected using Sephadex G-25 c olumn, w ith the reduc ing pow er, OH and DPPH s
7、cavenging ratio being 0.236, 18.13% and 63.85% at the c onstration of 5 mg/mL, its relative molec ular mass was located 307 around. Conc lusion: The bioactive peptides from Loligo chinensis had a strong antioxidant capac ity in vitro after enzymatic digestion and purific ation on Sephadex G-25 colum
8、n c hromatography. Key words: Loligo chinensis; antioxidant peptides; papain; enzymatic hydrolysis - 5 - 1、前言 我国是一个海洋大国，拥有 1.8万千米的海岸线，渔业资源及其丰富。据 FAO渔业统计年鉴， 1998年我国鱿鱼年捕获量达 23.4万 t，约占世界总量（ 260 万 t）的 9%，但是国家对鱼及其副产品的利用，尤其是对其中蛋白的利用还只是处于初级阶段，如 目前鱿鱼加工的技术含量不是很高，主要产品有鱿鱼干、咸鱿鱼、罐头及调味品等，加工后的残余物（主要为鱿鱼头、足、内脏、表皮等）约
9、占 35%， 其中皮占 8%13%。实验以鱿鱼皮为原料，采用正交方法对其进行酶促水解从而得到氨基酸和肽的水解混合物，为鱿鱼皮作为营养源的利用提供可供参考的工艺数据。 鱿鱼，属软体动物门，头足纲，二鳃亚纲，十腕目，广泛分布于大西洋、印度洋和太平洋各海区，是重要的海洋经济头足类。近年来，随着鱿鱼钓船只数量和吨位的不断增加，以及鱿钓技术的逐渐成熟，鱿鱼成为国内主要的远洋渔捞品种，成为我国重 要的水产加工原料1， 2 鱿鱼富含各种维生素、微量元素、不饱和脂肪酸和牛磺酸等营养和功能性成分，是一种营养保健型且风味良好的水产品资源，经常食用具有很好的滋补作用，特别对腰肌劳损、风湿腰痛、产后体弱等有一定的疗效
10、，另外还有预防心脏病、高血压、脑血管疾病的作用。但是，我国目前鱿鱼加工停滞不前，多停留在鲜食、加工为鱿鱼丝和鱿鱼干，而对于高附加值功能肽产品的开发研究较少。鱿鱼胴体部分约占体重的 50%，富含人体必需的各种氨基酸，且必需氨基酸组成接近全蛋蛋白，是一种优质的蛋白来源。因此，借鉴已有的蛋白酶解工艺和活性 肽制备工艺 3-12，将有可能从中获得活性显著的功能肽产品，为鱿鱼的精深加工提供借鉴的依据。 自由基是人体生命活动中生物化学反应的中间产物，当机体处于不良环境状态或随着年龄的增长，体内的自由基产生过多或清除过慢，将破坏核酸、蛋白质、多糖和脂类化合物，损伤细胞的结构功能 13-14。 目前我国人均蛋
11、白摄入量比世界公认标准少 10g/d，优质蛋白资源更是严重不足，加之人体自身合成肽的能力的减弱，使得人们必须通过体外合成的活性肽补充原肽物质以养自身。 目前活性肽的生产方法主要有： （ 1）天然活性肽的分离提取：存 在于细菌、真菌、动植物等生物体内的激素、酶抑制剂等天然活性肽，经分离提取而得。该方法制备量少，价格昂贵，且不利于产业化。 （ 2）食品蛋白质水解制取活性肽：一般采用酸水解，工艺简单、成本低，但因氨基酸受损严重、质量较差和水解难控制而较少应用。 （ 3）化学合成活性肽：采用液相或固相化学合成法可制取任意需要的活性肽，但因成本高、副反应物及残留化合物多等因素而制约其发展。 因此，本实验
12、 利用正交实验对木瓜蛋白酶酶解制备鱿鱼蛋白抗氧化肽的工艺参数进行了优化，并利用 Sephadex G-25从酶解物中分离得到了活性较高 的抗氧化组分，研究结果为鱿鱼蛋白抗氧化肽的开发提供了依据。 - 6 - 2、材料与方法 2.1 材料 DPPH L-还原谷胱甘肽 木瓜蛋白酶（上海源聚生物科技有限公司进口分装） Sephadex G-25（ Pharmacia 进口分装） 所用水均为二次蒸馏水 Na2HPO4、 NaH2PO4（国药集团） 氢氧化钠 A.R. (北京化土厂 ) 鱿鱼于 2009 年 7 月购于舟山市南珍水产品市场，种属由浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定为中国枪乌贼 Loligo ch
13、inensis，标本存放于浙江海洋学院药学实验室。 - 7 - 2.2 主要设备与仪 器 HD 21C-A 核酸蛋白检测仪（上海康华生化仪器制造有限公司） SC-15 超级恒温槽（宁波江南仪器厂） Anke TDL-40B 离心机（上海安亭科技仪器厂） U-2800 紫外可见分光光度计（日本日立） AY120 电子分析大平 (C SHIMADZU 公司 ) 试管、烧杯 (50ml、 500 ml、 1000 ml)、量筒（ 10 ml、 50ml、 500 ml、 1000 ml）、 玻璃棒、洗气瓶、锥形瓶（ 50ml、 2000ml）、容量瓶（ 1000 ml）、滴管 2.3 试验方法 2.
14、3.1 酶解制备抗氧化肽工艺路线 鱿 鱼 除骨、脱脂肪 按 1： 1 的质量比加入磷酸盐缓冲液（ pH 7.0， 0.2 mol/L），高速组织捣碎机匀浆， 加木瓜蛋白酶酶解 酶解液加热（ 90 、 15 min），灭酶 离心取上清液 Sephadex G-25纯化。 2.3.2 木瓜蛋白酶酶解条件的优化 8 以 DPPH 清除率为指标考察加酶量、酶解时间、提取液 pH、温度对木瓜蛋白酶酶解制备鱿鱼蛋白抗氧化肽的影响。结果如图 2 5 所示。 根据单因素试验设计正交试验确定木瓜蛋白酶酶解制备鱿鱼蛋白抗氧化肽的工艺条件。L9（ 34） 正交试验设计因素和水平见 表 1。 表 1 因素水平表 Ta
15、ble 1 The design of fac tors and the level - 8 - 水平 因素 A酶解温度（ ） B酶解时间 （ min） C加酶量（ %） D酶解 PH值 1 45 3 0.8 6 2 50 4 1.0 7 3 55 5 1.2 8 2.3.3 鱿鱼蛋白酶解物的分离、纯化 9 在最佳酶解条件下用木瓜蛋白酶酶解鱿鱼蛋白，再经 Sephadex G-25层析分离。分离条件：凝胶柱 2.0 cm 45 cm，上样量 2 mL，磷酸盐缓冲液（ pH 7.0， 0.2 mol/L） 为洗脱剂，洗脱流速 0.2 mL/min，检测波长 280 nm，收集速度 4 mL/管。
16、标准品为还原谷胱甘肽（ GSH，相对分子质量 307.32）。 2.4 抗氧化试验 2.4.1 DPPH DPPH 自由基清除能力按照 Bersuder（ 1998）描述的方法进行 10。 500 L 样品与 500 L的 99.5%乙醇混合，加入 125 L DPPH浓度为 0.02% 的 99.5%乙醇溶液。混合物在暗室室温下放置 60 分钟，于 517 nm 处测定吸光值。 自由基清除率按照下面公式计算：清除率 % =（对照 +空白 -样品） /对照。 对照： 500 L 蒸馏水 + 125 L 浓度为 0.02% DPPH 99.5%乙醇液 + 500 L 乙醇 99.5%；样品： 5
17、00 L 样品 + 125 L 浓度为 0.02% DPPH 99.5%乙醇液 + 500 L 乙醇；空白： 500 L样品 + 125 L 乙醇 + 500 L 乙醇。 2.4.2 还原力 酶解液还原力测定按照 Oyaizu（ 1988）方法进行 11。 2 mL 样品和 2 mL 磷酸盐缓冲液（ 0.2 mol/L， pH6.6） + 2 mL 的 1%铁氰化钾，混合物在 50 保温 20 分钟，然后加入 2 mL的三氯乙酸（ 10%），取出 2 mL 混合物加入 2 mL 蒸馏水和 0.4 mL 三氯化铁（ 0.1%）于试管中，反应 10 分钟后，测定 700 nm 处吸光值，吸光值高表
18、明还原力高。 2.4.3 清除羟自由基能力的测定 12 取浓度为 0.75 mmol/L邻二氮菲 1 mL于试管中，依次加入 2 mL 磷酸盐缓冲液（ pH 7.4），1 mL蒸馏水，充分混匀后，加入浓度为 0.75 mmol/L的硫酸亚铁 1mL，混匀，加入 1 mL质量分数为 0.12%的 H2O2， 37 水浴 90 min，于 536 nm波长 测其吸光度，为 Ap； 用 1 mL蒸馏水代替 1 mL H2O2，为 Ab；用样品代替 1 mL的蒸馏水，为 As。 羟自由基清除率 =（ As - Ap） /（ Ab - Ap） 100% 3、结果与讨论 3.1 单因素实验 3.1.1 酶
19、解时间对鱿鱼蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 - 9 - 如图 1 所示：酶解时间对酶解度的影响显著。随着酶解时间的延长，鱿鱼蛋白酶解产物的 DPPH 清除率逐渐增加， 4 h 的酶解产物对 DPPH 的清除率达到最高值，而超过 4 h 酶解产物对 DPPH 的清除率迅速下降，因此酶解时间以 4 h 小时为宜。 20304050601 2 3 4 5 6 7时间（h ）DPPH清除率（%）图 1 酶解时间对酶解产物 DPPH 清除 率的影响 Fig.1 Effec ts of enzymatic hydrolysis time on c learanc e rate of DPPH of
20、enzymatic hydrolysate 3.1.2 酶用量对鱿鱼蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 如图 2 所示：随着酶用量的增大，鱿鱼蛋白的酶解产物 DPPH 清除率上升；当酶用量超过 1.0%时， DPPH 清除率上升趋势趋缓，因此选择酶用量为 1.0%。 20304050600 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4加酶量（% ）DPPH清除率（%）图 2 酶用量对酶解产物 DPPH 清除率的影响 Fig.2 Effects of amount of enzyme on c learance rate of DPPH of enzymatic hydrolysate
21、3.1.3 酶解温度对鱿鱼蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 如图 3 所示：在一定温度范围内， 温度对鱿鱼蛋白的酶解产物 DPPH 清除率影响显著。随着温度的上升， DPPH 清除率逐渐增大。当温度超过 45 时 DPPH 清除率开始下降，所以选择酶解温度选择为 45 。 020406035 40 45 50 55 60 65温度（）DPPH清除率（%）图 3 酶解温度对酶解产物 DPPH 清除率的影响 - 10 - Fig.3 Effec ts of temperature on c learanc e rate of DP PH of enzymatic hydrolysate 3.1
22、.4 酶解液 pH 值对鱿鱼蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 如图 4 所示： pH 对鱿鱼蛋白酶解产物的 DPPH 清除率的影响显著。随着 pH的上升，DPPH 清除率逐渐增大。当 pH达到 7.0 时 DPPH 清除率达到最高值，随后开始下降。所以选择酶解液 pH 为 7.0。 20304050603 4 5 6 7 8 9PHDPPH清除率（%）图 4 酶解液 pH 对 酶解产物 DPPH 清除率 的影响 Fig.4 Effec ts of pH on c learanc e rate of DPPH of enzymatic hydrolysate 3.2 正交试 验及数据处理 在
23、实际操作中，各因素之间会相互交叉影响。因此，为了全面考察影响因素， 在单因素试验及数据分析基础上，以酶用量、酶解温度、 pH 值、酶解时间为考察因素，每个因素各取 3 个水平（表 1），并以 DPPH 清除率为考察指标，做 L9（ 34） 正交试验（表 2）。 表 2 木瓜蛋白酶酶解鱿鱼蛋白酶制备抗氧化肽的正交实验结果 Table 2 Orthogonal experiment results of papain enzymatic hydrolysis Loligo chinensis for preparing antioxidatation peptides 实验号 因素 DPPH清除率
24、（ %） A酶解温度（ ） B 酶解时间 （ h） C 加酶量（ %） D酶解 pH值 1 45(1) 3(1) 0.8(1) 6(1) 41.73 2 45 (1) 4(2) 1.0(2) 7(2) 44.96 3 45 (1) 5(3) 1.2(3) 8(3) 39.86 4 55(2) 3(1) 1.0 (2) 83) 54.78 5 55 (2) 4(2) 1.2 (3) 6(1) 52.52 6 55 (2) 5(3) 0.8 (1) 7(2) 45.86 7 50(3) 3(1) 1.2 (3) 7(2) 51.86 8 50 (3) 4(2) 0.8 (1) 8(3) 42.67 9 50 (3) 5(3) 1.0 (2) 6(1) 40.83 k 1 42.183 49.457 43.420 45.027 k 2 51.053 46.717 46.857 46.560 k 3 45.120 42.183 48.080 45.770
