1、 本科毕业论文 （ 20 届） 鱿鱼墨多肽对 DU-145 细胞的早期凋亡抑制研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 . 1 ABSTRACT . 2 前言 . 3 1 实验材料、主要器材与仪器 . 3 1.1 材料 . 3 1.2 主要器材及仪器 . 3 1.3 药品的配制 . 3 2 实验方法 . 4 2.1 鱿鱼墨多肽提取工艺 . 4 2.2 鱿鱼墨多肽脱脂提取工艺 . 4 2.3 鱿鱼墨多肽酸法提取正交实验 . 4 2.4 抗癌活性试验 . 4 2.4.1 细胞培养 . 4 2.4.2 细胞增殖抑制率的测定 . 4 2.4.3 细胞
2、形态学观察 . 5 3 结果与讨论 . 5 3.1 脱脂对酸解提取鱿鱼墨 多肽 的影响 . 5 3.2 正交试验及数据处理 . 5 3.3 鱿鱼墨多肽对 DU-145 细胞增殖抑制作用 . 6 3.4 鱿鱼墨多肽作用后 DU-145 细胞形态学变化 . 7 4 小结 . 8 参考文献 . 8 致 谢 . 错误 !未定义书签。 、 1 摘要 目的：研究鱿鱼墨多肽酸法提取的工艺及不同浓度 鱿鱼墨多肽 对 DU-145 细胞 的增殖抑制作用。方法：通过 以 酸的种类、料液比、酸解时间和 酸解温度为因素，以酸解液的氨基氮含量为指标进行正交实验 确定提取 鱿鱼墨多肽的最佳 酸解条件，再通过 MTT 法检
3、测其对DU-145 的生长抑制作用及 HE 染色法观察 其 对 DU-145 细胞 形 态学的影响。结果：酸法提取鱿鱼墨多肽最佳组合为 0.01 mol/L 盐酸、 酸提料液比 1： 2、酸解时间 72 小时、酸解温度 35 ；鱿鱼墨多肽 对 DU-145 细胞有增殖抑制作用并 能 诱导 DU-145 细胞凋亡。结论：鱿鱼墨多肽能破坏细胞结构，诱导前列腺癌 DU-145 细胞凋亡的发生。 关键词 鱿鱼墨多肽； DU-145 细胞；增殖抑制 2 Study on inhibition of early apoptosis of squid ink peptides on DU-145 cells
4、 Abstract To observe squid ink peptides with the different concentrations on inhibiting the cellular growth and indueing apoptosis of DU-145 cells. Methods: MTT assay was used to identify squid ink peptides on the growth inhibition of DU-145 and HE staining squid ink DU-145 peptides on the morpholog
5、y of cells. Results: The squid ink peptides can remarkably inhibit the proliferationof DU-145 cells and induees the apoptosis of DU-145 cells in vitro.Conclusion: The squid ink peptides could inhibit prostate cancer DU-145 cell growth by directly damaging cellular ultrastructure and interfering. Key
6、 words Squid ink； Peptides； DU-145 Cells； Proliferation 3 前言 在欧美国 家 前列腺癌 (prostate cancer， PCa)的发病率处于男性恶性肿瘤的第一位，死亡率仅次于肺癌，居第二位。近几年来，我国随着人口老龄化， PCa 的发病率有明显上升趋势，己成为影响老年男性健康的一大疾患；虽然 PCa 的发病率低于欧美国 家 ，但死亡率却远高于欧美国 家 。 由于 癌症患者长期化疗损害重要脏器，且会产生肿瘤耐药性，影响化疗效果 1-2。因此，寻找低毒、高效的新型抗癌药物势在必行。海洋是生命的起源地，海洋环境又具有高盐、高压、低温等迥异
7、于陆地环境的特点，许多海洋生物在这种极端环境中产生了大量不同于陆地生物的活性物质，结构新颖，如具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、 抗衰老、增强机体免疫力 等活性物质。其中抗肿瘤活性物质最为引人瞩目，已经成为全世界科学家们研究的热 点。本文选取的北太平洋鱿鱼墨（ Squid ink） 是生活在海洋中的软体动物。在分类学上，鱿鱼是属于软体动物门，头足纲，二鳃亚纲，十腕目的动物 3。研究鱿鱼墨囊抑制前列腺癌 DU-145 细胞作用为切入点，以开发鱿鱼墨中的生物活性物质，不仅提高鱿鱼加工过程中废弃物的综合利用率，为研发海洋药物开拓一个新的来源，更能促进我国远洋渔业水产品加工废弃物的高值化利用的发展 4。 1
8、实验材料、主要器材与仪器 1.1 材料 取新鲜的北太平海洋鱿鱼墨； DU-145 细胞株 (原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存）， 柠檬酸 (中国上海试剂总厂 ),盐酸、醋酸、 甲醛、氢氧化钠、丙酮 (国药集团化学试剂有限公司 )， 胎牛血清（ FBS），二甲基亚砜 DMSO， (MTT)。 1.2 主要器材及仪器 96 孔培养板，微量移液器，超净工作台， CO2 培养箱，伯乐酶标仪（日本）， Olympus Bx 41 倒置显微镜（日本）， Opympas Cx 31 显微镜（ Philippines）， CF16RX -2 高速冷冻离心机（日本）， TG16-WS 台式离心机（长沙
9、湘智离心机仪器公司）， BSAR4S 电子天平（北京赛多利斯科学仪器）。 1.3 药 品的配制 称量 0.8g 鱿鱼墨多肽，以 8ml 营养液溶解，离心 (4650 r/min)30 分钟备用。 2 实验方法 2.1 鱿鱼墨多肽提取工艺 将预处理过的鱿鱼墨取 10.0 mL，与适量的酸提料液 ,在一定的温度、时间下浸提 ,并最后对浸提液离心得到的清液即为粗制的多肽。 2.2 鱿鱼墨多肽脱脂提取工艺 将预处理过的鱿鱼墨取 10.0 mL，与适量的酸提料液 ,再加适量丙酮，在一定的温度、时间下浸提 ,并最后对浸提液离心得到的清液即为粗制的多肽。 4 2.3 鱿鱼墨多肽酸法提取正交实验 以 氨基 态
10、氮 为指标来优选对酸水解制备鱿鱼墨多肽有影响的酸的种类、酸提料液比、酸解时间、 酸解温度。 根据单因素试验设计正交试验确定酸解制备鱿鱼墨多肽的工艺条件。 L9（ 34） 正交试验设计因素和水平见 表 1。 表 1 因素水平表 水平 因素 A酸 B酸提料液比 C酸解时间（ h） D酸解温度（ ） 1 0.01 mol/L 盐酸 1: 2 48 35 2 0.5 mol/L 柠檬酸 1:3 72 45 3 0.5 mol/L 醋酸 1:4 96 55 2.4 抗癌活性试验 2.4.1 细胞培养 选取 PCa 细胞 DU-145（原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存），用含 10%小牛血清的
11、RPMI1640 完全培养基于 37 、 5% CO2 培养箱中培养至对数生长期 5。 2.4.2 细胞增殖抑制率的测定 取对数生长期的 DU-145 细胞，用含 10%胎牛血清的 DMEM 培液配制成 3.0x104 个 /mL 的单细胞悬液接种于 96 孔培养板中，每孔 100uL，培养 24h 后，弃去旧液，加入新鲜培养液，每孔 180uL，然后分别加入不同浓度的 鱿鱼墨多肽 ，每孔终体积为 200uL。实验分为两组 : 药物组 :加入 鱿鱼墨多肽 ，终浓度分别为 1mg/mL 、 5mg/mL、 10 mg/mL、 15 mg/mL、 20 mg/mL、200 mg/mL; 对照组 :
12、加入等体积含等容积的培养液。每组设 8 个平行孔。本底对照加入等体积含相应浓度药物的无细胞培养液作为调零孔 6-7。置 37 、 5% CO2、饱和湿度的条件下培养 24h后，每孔加入 MTT 液 (5mg/mL)20uL，继续培养 4h，弃去培养液，每孔加 200UL DMSO，避光振荡 10 分钟，用酶标仪测定吸光度 (A)值，检测波长 570nm。按下式计算生长抑制率 IR=(对照组 A 值 -药物组 A 值 )/对照组 A 值 100%。 2.4.3 细胞形态学观察 HE 染色光学显微镜下观察并拍照，分析细胞凋亡情况 8-9。 3 结果与讨论 3.1 脱脂对酸解提取鱿鱼墨 多肽 的影响
13、 鱿鱼墨在酸解中有无脱脂对酸解度的影响显著。在每次酸解实验中，脱脂后的酸解度都明显小于不脱脂的。特举一图例： 0.5 mol/L醋酸 酸提料液比 1： 2、酸解时间 96小时、酸解温度 45 （图 1）。 5 00.050.10.150.20.250.30.350.5mol/l醋 酸 1： 2酸 提料比 酸 解96小 时 温 度45ANNg/100ml无脱脂脱脂图 1 鱿鱼墨在酸解中有无脱脂对酸解度的影响 3.2 正交试验及数据处理 实验采用酸的种类、酸提料液比、酸解时间、 酸解温度 4个因素，每个因素取 3个水平，将处理后的鱿鱼墨置室温下，每 份取 10 mL鱿鱼墨在不同的条件下反应，测得的
14、氨基态氮及数据进行处理，结果见表 2。 表 2 影响鱿鱼墨 多肽 提取的 L9（ 34） 实验结果分析表 实验号 因素 氨基 态氮(g/100ml) A酸 B酸提料液比 C 酸解时间 （ h） D 酸解温度（ ） 1 0.01mol/L 盐酸 1:2 48 35 0.3618 2 001 mol/L 盐酸 1:3 72 45 0.2953 3 0.01 mol/L 盐酸 1:4 96 55 0.1973 4 0.5mol/L 柠檬酸 1:2 72 55 0.2693 5 0.5mol/L 柠檬酸 1:3 96 35 0.2275 6 0.5mol/L 柠檬酸 1:4 48 45 0.1959
15、7 0.5 mol/L 醋酸 1:2 96 45 0.3144 8 0.5 mol/L 醋酸 1:3 48 55 0.1757 9 0.5 mol/L 醋酸 1:4 72 35 0.2241 k1 0.8544 0.9455 0.7334 0.8134 k2 0.6927 0.8375 0.7887 0.8056 k3 0.7142 0.6173 0.7392 0.6423 R 0.1617 0.3288 0.0553 0.1711 6 如表 2 所示：从极差 R 值可以看出，各因素对酸法提取鱿鱼墨多肽的主次顺序为酸提料液比 (B) 酸解温度 (D) 酸的种类 (A) 酸解时间 (C) ，即酸
16、提料液比是条件中影响最大的因素，酸解时间的影响最小，酸法提取鱿鱼墨多肽最佳组合为 0.01 mol/L 盐酸、 酸提料液比 1：2、酸解时间 72h、酸解温度 35C 。 3.3 鱿鱼墨多肽对 DU-145 细胞增殖抑制作用 不同浓度的鱿鱼墨多肽作用于体外培养的 DU-145 细胞 24h， MTT 法测定其对 细胞增殖的抑制率，结果显示鱿鱼墨多肽对 DU-145 细胞有显著的增殖抑制作用，且随着鱿鱼墨多肽浓度的增加，其抑制率逐渐升高，存在明显的剂量依赖性 (见表 3，图 2)。 表 3 鱿鱼墨多肽对 DU-145 细胞增殖的影响 组 药物浓度 （ mg/ml） OD (xs) 细胞生长抑制率
17、 （ %） 对照组 0 0.4810.048* 1 5 0.3350.012* 13.454 2 10 0.2670.012* 30.080 3 15 0.2260.015* 45.731 4 20 0.1750.009* 57.281 5 25 0.1460.007* 65.586 6 30 0.1270.006* 78.193 * P0.05 与对照组比 鱿鱼墨多肽对D U - 1 4 5 细胞增值抑制的影响0204060801005mg/ml 10mg/ml 15mg/ml 20mg/ml 25mg/ml 30mg/ml浓度（m g / m l )增值抑制率（%）图 2 鱿鱼墨多肽 对
18、DU-145 细胞的抑制率 3.4 鱿鱼墨多肽作用后 DU-145 细胞形态学变化 HE 染色光学显微镜下观察，对照组细胞保持原有的生长形状，呈多边形，细胞核大小不一，呈圆形或卵圆形，核分裂相多，核仁数目多，核浆比例高 10-11。鱿鱼墨多肽作用后可见细胞形7 态不规则，异型性明显，部分细胞质出现大小数目不等的空泡，核仁数目减少 ;细胞 轮廓模糊，细胞质碱性降低，巨核细胞增多，染色质凝聚，核固缩（图 3）。 8 图 3 鱿鱼墨多肽作用 DU-145 细胞（ 24h） 图 3-1 对照组；图 3-2 用鱿鱼墨多肽 10 mg/ml， 细胞形态不规则，出现早期凋亡现象 ； 图 3-3 用鱿鱼墨多肽
19、 20 mg/ml， 异型性明显，部分细胞质出现大小数目不等的空泡，染色质凝聚，细胞核固缩，细胞凋亡明显。 4 小结 随着老龄化社会的到来 ,我国前列腺癌发病率有明显增加的趋势。对于非激素依赖型前列腺癌，目前仍无有效的治疗方法 ,只有局限于胞膜内的早期前列腺癌可以得到 根治，对转移性前列腺癌 ,虽然内分泌等治疗可使 70% 80%的患者症状缓解，但病人往往在几个月或几年内死于肿瘤的扩散。因此 ,寻找疗效好，副作用小的药物是当今面临的重要课题 12-13。 本实验 采用酸法提取，浓缩等方法提纯鱿鱼墨多肽，并通过正交试验得到最佳酸解工艺，条件为 0.01 mol/L 盐酸、 酸提料液比 1： 2、
20、酸解时间 72 小时、酸解温度 35 。过 MTT 法检测其对 DU-145 的生长抑制作用，结果表明鱿鱼墨多肽对 DU-145 细胞有显著的增殖抑制作用，且随着鱿鱼墨多肽浓度的增加，其抑制率逐渐升高，存在明显的剂 量依赖性，这进一步支持了鱿鱼墨多肽通过抑制细胞增殖从而抑制肿瘤形成的结论。 目前，有关细胞凋亡的实验室检测手段主要是从细胞凋亡的形态学和生物化学特征对其进行体外的定性及定量研究 14。 在对 HE 染色光镜下观察 中 （图 3），对照组细胞保持原有的生长形状，呈多边形，细胞核大小不一，呈圆形或卵圆形，核分裂相多，核仁数目多，核浆比例高。鱿鱼墨多肽作用后可见细胞形态不规则，异型性明显，部分细胞质出现大小数目不
