1、 本科毕业论文 （ 20 届） 仙人掌多糖微波辅助提取的正交实验工艺研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目 录 摘要 . 3 ABSTRACT . 4 1 前言 . 5 1.1 概述 . 5 1.2 仙人掌的国内外研究进展 . 5 1.3 微波提取的特征 . 5 1.4 本文研究的内容与意义 . 6 2 仪器与材料 . 7 2.1 实验仪器 . 7 2.2 实验材料 . 7 2.2.1 主要试剂 . 7 2.2.2 仙人掌样本 . 7 3 实验方法 . 7 3.1 样品预处理 . 8 3.2 仙人掌多糖的提取 . 8 3.3 不同因素对仙人掌多糖提
2、取量的影响（单因素实验） . 8 3.3.1 制定葡萄糖标准曲线 . 8 3.3.2 多糖提取量得测定 . 8 3.3.3 微波功率对仙人掌多糖提取量的影响 . 8 3.3.4 温度对仙人掌多糖提取量的影响 . 8 3.3.5 提取时间对仙人掌多糖提取量的影响 . 8 3.3.6 料液比对仙人掌多糖提取量的影响 . 9 3.4 制定仙人掌多糖最佳制备工艺条件的正交试验 . 9 4 结果与讨论 . 10 4.1 不同因素对仙人掌多糖提取量的影响 . 10 4.1.1 绘制葡萄糖标准曲线 . 10 4.1.2 微波功率对仙人掌多糖提取量的影响结果 . 11 4.1.3 温度对仙人掌多糖提取量的影响
3、结果 . 12 4.1.4 提取时间对仙人掌多糖提取量的影响结果 . 12 4.1.5 料液比对仙人掌多糖提 取量得影响结果 . 13 4.2 正交实验仙人掌多糖粗品得量 . 14 4.3 不同溶剂对仙人掌多糖提取量的影响比较 . 15 5 结论 . 15 3 参考文献 . 15 致 谢 . 错误 !未定义书签。 4 摘要 仙人掌多糖具有明显的增强免疫、抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抗衰老等活性，是仙人掌具有多种功效的原因之一。本文通过改变提取影响因素以及利用正交实验，希望从中寻找到 仙人掌 多糖提取工艺的最佳参数组合，为后续的研究提供参考。实验 采用水作为溶剂，通过微波辅助提取多糖， Savage
4、法除蛋白，高浓度乙醇醇沉的方法提取出仙人掌多糖。 在微波辅助提取仙人掌多糖的实验中，微波具有破坏细胞，使多糖释放的作用，同时在微波功率 700 W，浸提时间 10 min，温度 70 ，液固比为 70时提取率最大，为 11.83 %。 关键词 仙人掌多糖； 微波 提取；分离纯化 5 The Orthogonal Experiment Technology of Studying Microwave-assisted Extraction from Cactus Polysaccharide Abstract Cactus polysaccharides have many obvious ac
5、tivities in immunity enhancing, antitumor, lowering blood sugar, antioxidation, anti-aging and so forth, which give birth to a variety of functions in cactus polysaccharide. This paper was aiming to find the optimum parameters combination in cactus polysaccharide extraction process by changing influ
6、ence factors and using orthogonal experiment, and meanwhile provide a reference for subsequent studies. By using water as solvent, assisted with microwave to extract polysaccharide; use Savage method to detach protein, and high concentration ethanol sank method to extract cactus polysaccharide. In t
7、he microwave-assisted extraction of cactus polysaccharides, microwave was found to be capable of destroying cells, and releasing the polysaccharides. Meanwhile, it was found that the maximum extraction rate of 11.83%, could be achieved under the optimal condition of 700W in microwave powder,10 min o
8、f leaching time, temperature of 70 , and the liquid-solid ratio of 70. Key words Cactus polysaccharide; Separation and purification; Microwave extraction 6 1 前言 1.1 概述 仙人掌属 （ Opuntia)植物系仙人掌科双子叶植物。多年生，叶常退化，茎肉质常有刺或刺毛，为热带、亚热带植物，多生长于干旱、沙漠或半沙漠地区。我国的野生仙人掌资源十分富 , 在 四川、云南、广东、贵州、海南等地区都分布有野生仙人掌。其中作为药用的种类主要有：仙
9、人掌 (Opuntia dillenii Haw)、印度仙人掌 (Opuntia ficus indica Mill)、 绿 仙人掌 (Opuntia monacantha Haw)等 , 它们 主要分布在我国南部沿海的沙滩上，具有很强的繁殖和环境适应能力。仙人掌性寒味苦，具有解毒镇痛、消肿排脓、行气活血等功效。仙人掌属植物的主要化学成分有多糖、蛋白质、黄酮类化合物、生物碱类化合物、脂肪、果实中的色素成分、超氧化物歧化酶 (SOD)、有机酸类以及以 - 谷甾醇为主的甾体等。 1.2 仙人掌的国内外研究进展 众多的研究表明，仙人掌多糖是仙人掌具有多种功效的原因之一。仙人掌中的糖类主要存在于茎的黏
10、液质中，黏液质和黏液质细胞是仙人掌植物的特征之一 。仙人掌茎中所含的多糖主要是由鼠李糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖及糖醛酸等聚合而成。现代医学研究表明 ,仙人掌多糖药理作用广泛，含有的活性成分多糖具有显著的抑制肿瘤、抗炎、抗疲劳、抗应激、降血糖、增强机体免疫力的作用。 （ 1） 抗癌：汲晨锋等 1-2研究了药用仙人掌多糖，食用仙人掌多糖及仙人球多糖三种仙人掌多糖对荷瘤小鼠 (S180和 H22) 的抑瘤作用。结果表明：三种多糖对 S180荷瘤小鼠肿瘤有抑制作用 ,对 H22荷瘤小鼠有延长存活时间的作用。此外 ,他们的研究还表明三种多糖对人白血病细胞、肺腺癌细胞、宫颈癌细胞的 生长均有很好的抑制作
11、用。 （ 2）抗氧化、抗衰老：杨贝等 3的研究表明 ,仙人掌多糖对 H2O2和 Fe2+体系产生的 -OH具有很好的清除能力，对连苯三酚自氧化速率亦有较为显著的抑制作用。这就说明了仙人掌多糖具有较强的抗氧化作用。武毅等 4的研究发现 ,仙人掌茎粗多糖能明显降低老年大鼠血清丙二醛含量及脑和肝组织脂褐质含量 ,并能明显提高老年大鼠血清超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性 ,从而可以推测仙人掌茎粗多糖具有抗氧化、抗衰老作用 ,其机制可能与改善自由基代谢有关。此外 ,徐霞等 5报道 ,仙人掌粗多 糖 (水提物 )可提高小鼠抗疲劳和耐缺氧能力。 （ 3）增强免疫活性：季宇彬等 6研究发现
12、，仙人掌多糖通过改善荷瘤小鼠红细胞膜功能 ,从而增强了小鼠的免疫功能 ,具有较强的免疫活性。刘洁等 7的研究也表明 ,仙人掌粗多糖能使正常小鼠胸腺及脾脏重量增加 ,提高网状内皮系统的吞噬能力。此外 ,还能增强机体对非特异性刺激的抵抗力。仙人掌多糖可增强人体免疫力，可能是对某些癌症、心脑血管疾病和糖尿病具有一定疗效的药理基础之一。 （ 4）降血糖：在我国仙人掌复方制剂已用于糖尿病的治疗 ,并且有仙人掌及其配伍降血糖药理作用的报道。有研究 人员用 0.75 %的酸水提取浸提仙人掌 ,加无水乙醇至 75%得到沉淀。用该提取物 (主要成分应为多糖 )对小鼠进行实验，结果表明该酸水提取物能显著降低正常小
13、鼠和四氧嘧啶诱发糖尿病小鼠的血糖。 2003年 Alarcon8的研究表明，两种仙人掌 (Opuntia ficus-indica和 O.streptacantha)中的多糖具有降血糖的作用。陶美华 9的研究也证明，仙人掌粗多糖能显著缓解糖尿病小鼠的多饮多食、消瘦等症状，具有明显的降血糖作用。 由于仙人掌粗多糖能改善糖尿病小鼠的体液免疫，增强巨噬细胞的吞噬功能。 因而可以7 推测，仙人掌粗多糖的降糖机理可能与提高糖尿病小鼠的免疫功能 ,调节胰岛素和其受体的结合以及提高机体对胰岛素的敏感性有关。此外 仙人掌可以调节机体代谢 , 增加微循环 , 改善肠胃功能 , 溶解血栓 ,促进伤口愈合 ,对 流
14、行性腮腺炎有一定疗效。 因此 , 对仙人掌多糖的研究 越来越受到研究人员的重视。 1.3 微波提取的特征 （ 1） 在高频微波的作用下，溶剂与溶质中的偶极分子产生偶极涡流，离子传导和高频率摩擦从而在极短时间内产生极大的热量。偶极分子旋转导致的弱氢键破裂、离子迁移等还加速了溶剂分子对样品机体的渗透使待提物很快 溶剂化。这种现象可使微波萃取时间显著缩短 10。 （ 2） 加热均匀， 传统加热是由外部热源通过传导和对流的方式由表及里对物体加热。而微波加热是物体在电磁场中由介质损耗而引起的体加热，其能量是通过空间或者媒质以电磁波的形式来传递，与物质内部分子的极化有密切关系。透入物体内部的微波能量被物体
15、吸收转换成热能从而对物体加热，此时物体的表里温升均匀 11。 （ 3） 微波加热过程中除热效应之外还有生物效应。由于物体内部的水份为极性分子，在微波的变交电磁场作用下引起强烈的极性震荡，导致细胞分子的间氢键松弛以及细胞膜结构电击 穿破裂，加速了溶质对机体的渗透和待提取成分的溶剂化 12。 1.4 本文研究意义与内容 本实验对微波辅助萃取仙人掌多糖的工艺进行研究，通过改变料液比、微波加热时间、微波功率以及温度这四个对影响仙人掌萃取的主要因素，从而利用正交实验，希望从中寻找到仙人掌 多糖提取工艺的最佳参数组合。 2 仪器与材料 2.1 实验仪器 仪器名称 型号 厂家 高速万能粉碎机 FW100 天
16、津市泰斯特仪器有限公司 电热 恒温 水浴锅 HWS12 上海一恒科学仪器有限公司 超声波 清洗 器 SK5200H 上海科导超声仪器有限公司 旋转蒸发 器 RE-52 上海亚荣生化仪器厂 循环水式多用真空泵 SHB-IIIA 河南省太康科教器材厂 电子天平 BSA323S 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 超纯水器 UPWS-I-20T 杭州永洁达净科技有限公司 紫外可见分光光度计 U-2800 日本日立紫外可见分光光度计有限公司 微波催化合成萃取仪 XH-100A 北京祥鸽科技发展有限公司 离心机 TDL-40B 上海安亭科技仪器厂 真空干燥箱 DZF-6050 上海精宏实验设备有限公司 2
17、.2 实验材料 2.2.1 主要试剂 试剂 厂家 8 葡萄糖对照品 国药集团化学试剂有限公司 浓硫酸 （ AR） 国药集团化学试剂有限公司 95%乙醇 （ AR） 国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇 （ AR） 国药集团化学试剂有限公司 正丁醇 （ AR） 国药集团化学试剂有限公司 氯仿 （ AR） 国药集团化学试剂有限公司 纯净水 浙江海洋学院药学实验室 2.2.2 仙人掌样本 新鲜 仙人掌 (Opuntia dillenii Haw) 采于 2010 年 10 月在舟山市定海区长冈山。 3 实验方法 3.1 样品预处理 将仙人掌去刺洗净，于干燥箱中干燥，切块粉碎， 将其杆磨成 50 目粉末
18、备用。 3.2 仙人掌多糖的提取 准确称取 1.000 g 的 仙人掌 粉末于三颈瓶中，加入蒸馏水，微波提取。 离心分离 20 分钟，抽滤，滤渣加入适量的水洗涤，过滤三次，合并几次的提取液，减压浓缩至原体积的 1/4， Savage法除蛋白，活性炭脱色， 置于分液漏斗中静置 3 h，取上层溶液， 加入 4 倍体积的 95 %乙醇，静置 24 h，离心，取沉淀，真空冷冻干燥后得多糖粗品。取粗多糖粉末加蒸 馏水定容至 100 mL待用 13-15。 3.3 不同因素对仙人掌多糖提取量的影响（单因素实验） 3.3.1 制定葡萄糖标准曲线 准确称取干燥至恒重的葡萄糖标准品 100 mg, 置于 100
19、mL 容量瓶中 , 加蒸馏水溶解并稀释至刻度 ,配置成 1.00 mg/mL。精密吸取 0.0， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 mL。加入有塞试管，补水至 4mL。精密加入 6 %苯酚溶液 1 mL，迅速加入浓硫酸 5 mL，盖上塞摇匀，置于100水浴 10 min，冷却后于 490 nm 处测定吸光度，同样处理的蒸馏水作为空白。 表 1 葡萄糖标准曲线配置数据 以吸光度为纵坐标，多糖的浓度为横坐标，得标准曲线计算回归方程。（ 结果 见图 1） 3.3.2 多糖提取量的测定 取制备好的仙人掌多糖溶液 0.3 ml，补水至 4 mL，加入 6 %苯酚 1 mL，混匀后
20、加入浓硫编号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 4.0 3.9 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 6%苯酚 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 浓硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 9 酸 5 mL，沸水浴加热 15 min 取出，流水冷却，在 490 nm 下测定其吸光度， 各浓度平行测定三次，以 4.0 mL 水按同样操作为空白，。根据葡萄糖标准曲线得出仙人掌多糖溶液的浓度，计算仙人掌多糖提取量。 3.3.3 微波功率对仙人掌多糖提取量的影响 准确称取 1 g 仙人掌 粉末
21、 4 份，分别置于三颈瓶中，加入 90mL 的蒸馏水，温度 70 ，分别设置微波功率 500 W、 600 W、 700 W、 800 W，提取 10 min。然后按照 3.2 项方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖 提取率 ， 结果见图 2。 3.3.4 温度对仙人掌多糖提取量的影响 准确称取 1 g 仙人掌 粉末 4 份，分别置于三颈瓶中，加入 90 mL 的蒸馏水，微波功率 700 W，设置温度分别为 60 、 70 、 80 、 90 ，提取时间 10 min，然后按照 3.2 项方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖 提取率 ，结果见图 3。 3.3.5
22、 提取时间对仙人掌多糖的影响 准确称取 1 g 仙人掌 粉末 4 份，分别置于三颈瓶中，加入 90 mL 的蒸馏水，微波功率 700 W，温度 70 ，分别提取 6 min、 8 min、 10 min、 12 min。然后按照 3.2 项方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖 提取率 ，结果见图 4。 3.3.6 料液比对仙人掌提取量的影响 准确称取 1 g 仙人掌 粉末 4 份，分别置于三颈瓶中，微波功率 700 W，温度 70 ，分别加入 70 mL、 80 mL、 90 mL、 100 mL 的蒸馏水，提取 10 min。然后按照 3.2 项方法进行操作，用苯酚 硫酸法测
23、定多糖含量，计算 多糖 提取率 ，结果见图 5。 3.4 制定仙人掌多糖最佳制备工艺条件的正交试验 3.4.1 仙人掌多糖的制备 准确称取 1.000 g 的 仙人掌 粉末于三颈瓶中，加入蒸 馏水，微波提取。 离心分离 20 分钟，抽滤，滤渣加入适量的水洗涤，过滤三次，合并几次的提取液，减压浓缩至原体积的 1/4， Savage法除蛋白，活性炭脱色， 置于分液漏斗中静置 3 h，取上层溶液， 加入 4 倍体积的 95 %乙醇，静置 24 h，离心，取沉淀，真空冷冻干燥后得多糖粗品。取粗多糖粉末加蒸馏水定容至 100 mL待用 。 按表 2 进行正交试验 表 2 因素水平设置表 因素 料液比（
24、g/ml) 提取温度（ ） 微波功率（ w) 提取时间（ min） 1 1： 80 60 600 8 2 1： 90 70 700 10 3 1： 100 80 800 12 4 结果与讨论 4.1 不同因素对仙人掌多糖提取量的影响 10 4.1.1 绘制葡萄糖标准曲线 由以下数据， 得标准曲线回归方程为 y = 1.2176x - 0.0087，相关系数 R2 = 0.9990。 表 3 各浓度葡萄糖的吸光度 葡萄糖浓度 mg/ml 三次所测得 的吸光度 吸光度 平均值 0.1 0.112、 0.114、 0.109 0.115 0.2 0.219、 0.229、 0.234 0.227 0
25、.4 0.461、 0.453、 0.457 0.457 0.6 0.727、 0.737、 0.738 0.734 0.8 0.978、 0.991、 0.986 0.985 1.0 1.194、 1.201、 1.193 1.196 图 1 葡萄糖标准曲线 4.1.2 微波功率对仙人掌多糖提取量影响的结果 在提取温度为 70 ，提取时间 8min，料液比 1： 90（ g/ml）的条件下不同微波功率对仙人掌多糖提取量的影响见图 3-2。由图 3-2 可知，仙人掌多 糖的提取量随微波功率的增大先升高再降低，微波炉功率为 700 W 时，仙人掌多糖提取量最大。这可能是因为当微波功率小于700 W 时，随着微波功率的增加，浸提物所吸收的微波辐射能越多，物系的温度升高得越快，固液扩散的速度加快，温度越高对物料细胞的破坏作用越大，有利于物料有效成分的浸出，提高多糖的提取量。当微波功率大于 700 W 时，随着微波功率的增大，多糖提取量减小，可能是微波功率的增大，造成仙人掌多糖的化学性质的变化，降解为单糖或其他物质，而使多糖提取量下降 16。也可能是 当微波的功率太大时，细胞膜并不会无限制 的破碎，而微波对细胞内物质的选择性加热性能差异则减少，一些易溶于水的物质先被溶解，造成多糖的提取率降低 17。 图 2 微波功率对提取率的影响
