1、 本科毕业论文 （ 20 届） 鱿鱼墨多肽对 PC-3 细胞的 增殖 抑制研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 1 目 录 摘要 . 错误 !未定义书签。 Abstract . 错误 !未定义书签。 1、前言 . 4 1.1 鱿鱼墨多肽的研究概述 . 4 1.2 研究方法概述 . 5 2、实验材料、仪器与试剂 . 5 2.1 材料和试剂 . 5 2.2 主要器材及仪器 . 6 3、实验方法 . 6 3.1 鱿鱼墨多肽最佳提取法 . 6 3.1.1 鱿 鱼墨的制备 . 6 3.1.2 鱿鱼墨多肽的提取工艺 . 6 3.1.3 鱿鱼墨多肽脱脂提取 . 6
2、 3.1.4 鱿鱼墨多肽酸法提取正交实验 . 6 3.1.5 氨基态氮含量的测定 . 7 3.2 鱿鱼墨多肽的提取 . 7 3.3 HE 染色法 . 7 3.4 MTT 法 . 7 4、实验结果和讨论 . 8 4.1 正交试验及数据处理 . 8 4.2 HE 染色法制作常规切片 . 8 4.3 MTT 比色法检测情况 .11 5、小结 . 12 参考文献 . 12 2 鱿鱼墨多肽对 PC-3 细胞的 增殖 抑制研究 摘要 目的 ： 研究鱿鱼墨中提取的多肽对于前列腺癌中 PC-3 细胞的 增殖 抑制的作用。方法：采取 MTT 法和 HE 染色法后流式细胞仪分析及显微镜下形态学观察等方法。结果：与
3、对照组比较 ， MTT 法显示对 PC-3 细胞的增殖抑制作用增强； HE 染色法显示细胞凋亡增多。结论：鱿鱼墨中提取多肽对 PC-3 细胞具有 增殖 抑制作用。 关键词 鱿鱼墨多肽； PC-3 细胞； 增殖抑制 3 Squid ink peptides on PC-3 cell apoptosis research Abstract Objective: Study of protein extracted from squid ink for the PC-3 prostate cancer cells in early apoptosis effect. Methods: MTT met
4、hod and after HE staining and flow cytometry methods such as morphological observation under a microscope. Results: Compared with control group, MTT assay showed that on the PC-3 cell proliferation enhancement; HE staining showed increased apoptosis. Conclusion: The squid ink extract protein for pro
5、state cancer PC-3 cells apoptosis inhibition. Key words Squid ink protein; PC-3 cells; Proliferation 4 1、前言 前列腺是男性老年肿瘤 ， 据统计，世界范围内前列腺癌的发病率差别很大，与地区、种族、内在因素以及周围环境有关。前列腺癌变时一种很复杂的疾病过程，涉及遗传学、内分泌和其他渐变性因素 。 然而 , 现阶段前列腺癌的化学治疗并不理想 ， 用于治疗前列腺癌的药物主要集中于拮抗雄性激素分泌 ， 这不仅容易产生激素抵抗 ， 而且对非激素依赖的前列腺癌疗效不佳。因此寻找疗效确切且高效 、 低毒的
6、药物变得尤为重要。 海洋生物活性物质抗肿瘤研究是海洋生物活性物质开发与抗癌药物研究的一个重要领域。当前 ， 如何寻找能选择性地干预癌细胞信号传导、调控细胞增殖 和分化活动的低分子瘤抑制物是其中的重要方向 1。虽然鱿鱼加工量巨大，但有关其加工过程中产生的大量废弃物的综合利用却相对甚少。在加工过程中，其废弃物往往被丢弃，一些国家甚至为了处理这些加工废料损失巨大经济利益 2。开发鱿鱼废弃物的高值化加工的关键技术，全面提高鱿鱼废弃物的附加值，对提升我国对大宗海洋动物资源的利用能力，提高产品的技术含量和竞争力，建立鱿鱼产品开发、加工的技术平台，促进我国远洋渔业的发展具有重要的经济和社会意义。 鱿鱼学名中
7、国枪乌贼 ， 属软体动物门，头足纲，二鳃亚纲，十腕目 鱿鱼高蛋白低脂肪，富含人体必需的多种氨基酸，且必需氨基酸组成接近全蛋白，是我国主要的水产加工原料 3。我国鱿鱼加工主要以其胴体为主，而占鱿鱼体质量 1.3左右的墨囊尚未得到有效地综合开发利用 。 在美国和日本，鱿鱼墨汁因为安全无毒且着色力强，已被用作天然的黑色素应用于食品生产中。目前已研究的鱿鱼墨中的生物活性物质有：多肽片断、酸性多糖等 4。最近，又从乌贼墨中分离纯化酪氨酸酶，并且发现有抗癌活性 (最新发现它与肿瘤细胞发生作用 )5。 1.1 鱿鱼墨多肽的研究概述 20 世纪 80 年代日本报道鱿鱼墨具有抗溃疡等作用，其有效成分为一 种耐热
8、的肽多糖，可以用于生产保健食品的重要原料 6 日本有在腌渍鱿鱼时加入墨汁的习惯，除了调味外还认为它具有防腐作用 7。墨汁提取物具有抗菌特性已被证实，但目前未确认其机理是因含有溶菌酶之故还是由其它成分所引起的。最近的研究发现，墨囊中含有真黑色素 (eumelanin)，以共价结合、离子键和蛋白质结合的形式存在 8。 20世纪 90年代，日本青森产业技术中心和弘前大学发现阿根廷鱿鱼墨汁具有抗肿瘤作用，并从中提取得到一种高效抗癌活性成分多糖一蛋白复合体，此种墨粘多糖由 3 种单糖呈直线交叉形式结合而成，并且和 蛋白质分子相连，具有比较复杂的结构，其多糖部分主要由等摩尔比例的葡糖醛酸 (GIcA)、
9、N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc)和岩藻糖 (Fuc)构成 9。 鱿鱼是乌贼的一个种属，其来源丰富易得，其墨汁成分和乌贼十分相似。 乌贼墨的化学成分为黑色素和蛋白多糖复合体 10。日本研究人员运用生化分离技术对乌贼墨的蛋白多耱复合体进行分析，从中分离出一组抗肿瘤活性的肽聚糖，分别是： SIPG022A、 SIPG022B 和SIPG022C。从化学组成上看， SIPG022A 和 SIPG022B 比 SIPG022C 有更多的糖组分，但用Actinase E 消化后在乙酸纤维膜电泳中只显示一个区带，说明这三种肽聚糖中只有一种多糖链并被连到一种肽，其重复结构为 (-6Ga NAcal-GleA
10、 B 1-3Fuc d l 一 )n，只是聚合度不同。糖类部分主要含有等分子质量的葡萄糖酸 (GlcA)、 N乙酰半乳糖胺、岩藻聚糖 (Fuc)。多糖部分本身无抗肿瘤活性，这表明其抗肿瘤活性来自多糖同其他组分的复合体，如肽聚糖和色素嘞。肽链部分主要的氨基酸为：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸 11-13。 5 在鱿鱼的加工过程中 ， 墨囊多作为加工废弃物处理 ， 容易污 染环境，其主要化学成分是黑色素和蛋白多糖复合体。研究表明鱿鱼墨具有抗肿瘤、调节机体免疫功能、诱导多种细胞因子等生理活性 ， 并一直认为其主要的活性成分为多肽片断、酸性多糖、酪氨酸酶以及微量元素。有报道指出鱿鱼墨中肽聚糖
11、可以直接抑制肿瘤的生长也可以刺激机体的免疫应答间接抑制肿瘤的生长，而肽聚糖中的主要成分是蛋白。本文研究了鱿鱼墨蛋白对前列腺癌中 PC-3细胞具有凋亡抑制作用。 1.2 研究方法概述 HE 染色法又称苏木素 -伊红染色 ， 苏木素容易被氧化 ， 其氧化产物苏木红才是真正的染料。苏木红是一种酸性染料 ， 只有苏木红和铝结 合形成一种带正电荷的蓝色色精才是碱性的。带正电荷的蓝色色精和细胞核结合是通过正、负电荷的极性吸附来完成的 ， 也就是说 ， 带负电荷的脱氧核糖核酸根和带正电荷的蓝色色精进行极性吸附而完成染色 14。伊红是一种酸性红色胞浆性染料 ， 伊红溶于水中就能离解成带负电荷的色酸部分 ， 即
12、染料的有色部分 ;带正电荷的钠离子部分 ， 即染料的无色部分。酸性染料组织成分呈弥漫性染色 ， 这是由于组织成分的等电点一般都在 3.6 5.2 范围内 (细胞核 ， pH3.8 4.2； 细胞浆 pH4.6 5.0) 15。它们在弱酸性或弱碱性不可能进行极性吸附 而完成染色 ， 它们的染色可能是通过渗透作用或弥散作用而完成的 ， 因此和组织成分结合是不牢固的。 1983 年 Mosmman 首先报道 用 MTT 法来检测细胞活性 16。以后 ， 又有研究人员用此法测定抗癌药物对肿瘤增殖活性的效应 17。该方法简便、 实验周期短 (一般只需 4 6 天 )、 所需细胞数目较少、人为误差较小 、
13、 所得资料较精确 ， 且无放射性污染。因此它也就成为药物筛选的主要手段。它的原理是活细胞通过线粒体能量代谢过程，脱氢酶将 MTT 代谢形成蓝紫色甲噆沉积于细胞内或细胞周围 ， 形成甲噆的量与细胞增殖程度呈比例关系， 通过比色分析方法测定甲胳的量 ， 即可了解细胞的增殖情况 18。 2、实验材料、仪器与试剂 2.1 材料和试剂 试剂 厂家 试剂或材料 厂家 柠檬酸 盐酸 醋酸 甲醛 氢氧化钠 中国上海试剂总厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 丙酮 新鲜鱿鱼墨 PC-3 细胞株 胎牛血清 FBS） 二甲基亚砜 国药集团化学试剂
14、有限公司 北太平海洋 原购自中科院上海细胞库 6 2.2 主要器材及仪器 仪器 厂家 仪器 厂家 伯乐酶标仪 超净工作台 CO2 培养箱 96 孔培养板 微量移液器 Olympus Bx 41 倒置显微镜 CF16RX -2 高速冷冻离心机 日本 日本 日本 日本 TG16-WS 台式离心机 BSAR4S 电子天平 Opympas Cx 31 显微镜 85-2 恒温磁力搅拌器 PHS-25C 酸度计 SSWW 型微电脑电热恒温水槽 DHG-9053A 型电热恒温鼓风干燥箱 长沙湘智离心机仪器公司 北京赛多利斯科学仪器 Philippines 常州国华电器有限公司 上海理达仪器厂 上海博进实业有
15、限公司 上海惊宏实验设备有限公司 3、实验 方法 3.1 鱿鱼墨多肽最佳提取法 3.1.1 鱿鱼墨的制备 鱿鱼墨在 37 恒温水浴锅解冻 3.1.2 鱿鱼墨多肽的提取工艺 将预处理过的鱿鱼墨取 10.0 mL，与适量的酸提料液 ,在一定的温度 、 时间下浸提 ,并最后对浸提液离心得到的清液即为粗制的多肽。 3.1.3 鱿鱼墨 多肽 脱脂提取 将预处理过的鱿鱼墨取 10.0 mL，与适量的酸提料液 ,再加适量丙酮，在一定的温度、时间下浸提 ,并最后对浸提液离心得到的清液即为粗制的多肽。 3.1.4 鱿鱼墨多肽酸法提取正交实验 以 氨基态氮 为指标来优选对酸水解制备鱿鱼墨 多肽 有影响的酸的 种类
16、、酸提料液比、酸解时间 和 酸解温度。 根据单因素试验设计正交试验确定酸解制备鱿鱼墨 多肽 的工艺条件 。 L9（ 34） 正交试验设计因素和水平见 表 表 1 因素水平表 水平 因素 A酸 B酸提料液比 C酸解时间（ h） D酸解温度（ ） 1 2 3 0.01 mol/L 盐酸 0.5 mol/L 柠檬酸 0.5 mol/L 醋酸 1: 2 1:3 1:4 48 72 96 35 45 55 7 3.1.5 氨基态氮含量的测定 吸取含氨基酸约 20mg 的样品溶液于 100ml 容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取 20.0ml置于 200ml 烧杯中，加水 60ml，开动磁力搅拌器，用 0.
17、05mol/l 氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示 pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液 ml 数，供计算总算含量。加入 10.0ml 甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至 pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液 ml 数。 同时取 80ml 蒸馏水置于另一 200ml 洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至 pH8.2，（此时不计碱消耗量），再加入 10.0ml 中性甲醛溶液，用 0.05mol/l 氢氧化钠标准溶液滴定至 pH9.2，用蒸馏水代替样品 作为试剂空白试验。 氨基酸态氮（ %） =（ V1- V2） c0.014100/(5V) 式中： V1样品稀释液在加入甲醛后滴定至
18、终点（ pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积， ml； V2空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积， ml； c氢氧化钠标准溶液的浓度， mol/l； 0 014氮的毫摩尔质量， g/mmol。 3.2 鱿鱼墨多肽的提取 经正交实验得到最优鱿鱼墨中蛋白的提取条件 是鱿鱼墨与 0.01mol/L 的盐酸以 1:2 的比例相混合，在 35 的水浴锅中经 72 小时的酸化后，取出样品。 用高速冷冻离心机对样 品进行离心 ，离心时间为 20min。 离心取得上清液，用旋转蒸发仪对样品进行浓缩 ，在用冷冻干燥仪干燥 24 小时。得到鱿鱼墨多肽样品。 3.3 HE 染色法 取出培养
19、有细胞的 6张盖玻片，放入培养皿中，有细胞面的朝上，用 95%的酒精固定 15min，然后用 PBS 洗两次，每次时间都是 1min。用苏木素染色，染色时间为 5-10min，用自来水洗去多余的染料，使细胞核蓝化。 浸入伊红染色，染色时间为 0.5-1min，用自来水洗去多余的染料。采用梯度低 -高脱水的方法，用 50%、 75%、 95%无水乙醇 和 对玻片脱水各 5min，然后 用二甲苯透明 3 次，每次 1min，用中性树胶封片 。 3.4 MTT 法 取对数生长期的前列腺癌 PC-3 细胞 ， 以 0.25%胰酶消化 ， 计数 ， 接种于 96 孔培养板内 。每孔细胞密度为 1104
20、个 ， 每组设 4 个平行孔并设不含细胞的空白对照 ， 37 培养 24 h 使细胞贴壁 。 吸掉上清液 ， 每孔加入 200L 含 MTT 试剂的培养基。 继续培养 4h，再将培养液吸干，加入二甲基亚砜， 震荡后，用酶标仪 检测 5mg/ml、 10ml/ml、15mg/ml、 20mg/ml、 25mg/ml和 30mg/ml不同浓度的 死亡率 (检测时每孔加 150L 10%的 DMSO，震荡使甲臢晶体溶解 )。 8 4、实验结果和讨论 4.1 正交试验及数据处理 实验采用酸的种类、酸提料液比、酸解时间 和 酸解温度 4个因素，每个因素取 3个水平，取每份 10 mL鱿鱼墨在不同的条件下
21、反应，测得的 氨基态氮 及数据进行处理，结果见表 2。 表 2 影响鱿鱼墨 多肽 提取的 L9（ 34） 实验结果分析表 编号 因素 氨基态氮(g/100ml) A酸 B酸提料液比 C 酸解时间（ h） D酸解温度（ ） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k 1 k 2 k 3 R 0.01mol/L 盐酸 001 mol/L 盐酸 0.01 mol/L 盐酸 0.5mol/L 柠檬酸 0.5mol/L 柠檬酸 0.5mol/L 柠檬酸 0.5 mol/L 醋酸 0.5 mol/L 醋酸 0.5 mol/L 醋酸 0.8544 0.6927 0.7142 0.1617 1:2 1:3 1:4
22、 1:2 1:3 1:4 1:2 1:3 1:4 0.9455 0.8375 0.6173 0.3288 48 72 96 72 96 48 96 48 72 0.7334 0.7887 0.7392 0.0553 35 45 55 55 35 45 45 55 35 0.8134 0.8056 0.6423 0.1711 0.3618 0.2953 0.1973 0.2693 0.2275 0.1959 0.3144 0.1757 0.2241 如表 2 所示：从极差 R 值可以看出，各因素对酸 法提取鱿鱼墨多肽的主次顺序为 酸提料液比 (B) 酸解温度 (D) 酸的种类 (A) 酸解时间
23、(C) ，即酸提料液比是条件中影响最大的因素，酸解时间的影响最小，酸法提取鱿鱼墨 多肽最佳组合为 0.01 mol/L 盐酸、 酸提料液比 1：2、酸解时间 72h、酸解温度 35C 。 4.2 HE 染色法制作常规切片 图 1 正常 PC-3 细胞 9 图 2 15mg/ml 样品作用细胞 图 3 30mg/ml 样品作用细胞 HE 染色结果见图 1、图 2 和 图 3。图 1 是正常细胞保持原有的生长形状，呈多边形，细胞核大小不一，呈圆形或卵圆形，核分裂相多，核仁数目多。图 2、 图 3 中 细胞肿胀 ， 细胞器 变形或肿大，核仁数目减少 ； 细胞轮廓模糊，细胞质碱性降低，巨核细胞增多；虽然核无明显 形态学 变化，这是细胞 增殖抑制 的早期变化。 在某些 HE 染色玻片 中见到部分细胞核呈褐色或黑色 ， 结构不 清 ， 形似 “ 焦化 ” 的物质 ，此种变化与二甲苯有密切关系 ， 但它导致该变化的机制还有待进一步的研究 ， 可能是二甲苯挥发不净 ， 留下的结晶 ； 也可能与细胞核的 pH 值有关。
