1、 本科毕业论文 （ 20 届） 鱿鱼墨多肽对 SKBR3细胞的增值抑制究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 1 目录 摘要 3 关键词 3 ABSTRACT 4 1 前言 4 2 实验材料 、主要仪器与实验试剂 5 2.1 实验材料 5 2.2 主要实验仪器 5 2.3 实验试剂 6 3 试验方法 6 3.1 鱿鱼墨多肽提取工艺 6 3.2 鱿鱼墨多肽脱脂提取工艺 6 3.3 鱿鱼墨多肽酸法提取正交实验 7 3.4 MTT 法测定细胞增值抑制率 7 3.4.1 细胞培养 7 3.4.2 细胞增值抑制率的测定 7 3.4.3 细胞形态学观察 7 4 研究
2、结果与分析 8 4.1 正交实验及数据处理 8 4.2 鱿鱼墨多肽对 SKBR3 细胞增殖的作用 8 4.3 HE 染色观察 SKBR3 细胞形态 9 5 小结 11 参考文献 11 致谢 12 附录 英文翻译 13 附录 中文翻译 16 2 鱿鱼墨多肽对 SKBR3 细胞的早期凋亡抑制研究 摘要 目的：研究 鱿鱼墨多肽对 SKBR3 细胞的早期凋亡抑制研究 。方法：首先用酸法提取 鱿鱼墨多肽，然后取在最佳酸解条件下的 鱿鱼墨多肽用 MTT 法检测细胞增值抑制率，经 HE 染色后在显微镜下观察细胞形态。 结果： 鱿鱼墨多肽的最佳酸解条件是 0.01 mol/L 盐酸， 酸提料液比 1： 2，酸
3、解 时间 72h，酸解温度 35 C。 ml 时， 鱿鱼墨多肽对 SKBR3 有增值抑制作用并诱导 SKBR3 细胞凋亡。结论：鱿鱼墨多肽能破坏细胞结构，诱导乳腺癌 SKBR3 细胞凋亡。 关键词 鱿鱼墨多肽； SKBR3 细胞；增值抑制 3 Squid ink peptides on SKBR3 cells of early apoptosis Abstract Objective :Of squid ink peptides on SKBR3 cells of early apoptosis. Methods: First, squid ink extraction with acid p
4、eptide, and then take the best under the conditions of acid hydrolysis peptides squid ink detected by MTT cell proliferation inhibition by HE staining and cell morphology was observed under the microscope. Results: The best acid peptide squid ink solution conditions 0.01 mol / L hydrochloric acid, l
5、iquid ratio of 1:2 acid extracted, acid hydrolysis time of 72h, acid hydrolysis temperature 35 C. ml, squid ink value-added peptides on the inhibition of SKBR3 and SKBR3 cells induced apoptosis. Conclusion: The squid ink can damage the cell structure of peptides and induce apoptosis of breast cancer
6、 SKBR3 cells Key words Squid ink; Extracted peptides; Anti-tumor activity 4 1 前言 鱿鱼，属软体动物门，头足纲，二鳃亚纲，十腕目，广泛分布于大西洋、印度洋和太平洋各海区，是重要的海洋经济头足类 1。近年来，随着鱿鱼钓船只数量和吨 位的不断增加，以及鱿钓技术的逐渐成熟，鱿鱼成为国内主要的远洋渔捞品种，成为我国重要的水产加工原料。 近几十年来，生物活性多肽抗肿瘤作用研究一直是国内外研究热点，已从多种陆地生物及海洋生物中分离出了抗肿瘤多肽，部分已应用于临床 2。海洋生物具有物种及活性物质富于多样性的特点，当前已被做为各国研
7、究开发的热点，其中抗肿瘤活性物质的筛选进展迅速，大量具有抗肿瘤活性的多肽被分离出来 3。而在活性多肽的提取方法上，目前的研究已越来越多地集中在蛋白酶解上。 海洋是一个巨大的天然产物宝库，占地球表面积 71%。据估计约有 50 余万种动物和 13000余种植物栖息于海洋环境之中，海洋生物物种远高于陆地生物。生长在海洋特殊环境 (高盐、高压、缺氧、缺少光照等 )中的海洋生物，在其生长和代谢过程中，产生大量具有特殊化学结构特殊生理活性功能的物质 4。 21 世纪人类社会面临着“人口剧增、资源匮乏、环境恶化”三大问题的严峻挑战。随着陆地资源的日益减少，开发海洋，向海洋索取资源变得日益迫切，而开发海洋药
8、物已迫在眉睫。 近年来 ,国外出现大量涉及药物、食品、功能食品、化妆品、酶制剂、生物工具药方面的海洋天然产物专利产品。海洋活性物质的药理活性作用 主要包括影响中枢神经、抗肿瘤、抗菌抗病毒、心脑血管系统、抗炎、镇痛、抗氧化、降血糖等作用 ,许多化合物具有新药开发潜力 5。国际上已投入应用的经典海洋药物有头孢霉素、阿糖腺苷、阿糖胞苷等 ,这些也是最早开发成功的现代海洋药物 ,现正广泛用于临床。近年来开发成功的典型药物是来源于印度 -太平洋竽螺的镇痛药物 Ziconotide，其前体化合物是竽螺的肽类毒素 -contoxin,是一种可通过合成获得的药源，该药于 2000 年 6 月获得美国 FDA
9、证书 ,显示了广阔的应用前景。目前国际上有约 20 种海洋天然产物或其结构类似物正在 临床研究阶段，多为抗癌药物。更多的化合物则处于临床前研究阶段。 乳腺癌是女性最常见的恶性 肿瘤 之一，其 发病率 在我国女性恶性肿瘤中居第二位，且呈明显上升的趋势，尤其在一些沿海发达地区，如上海市，其发病率在 2000 年已跃居女性恶性肿瘤发病率之首 6。 因此，研究鱿鱼类动物的抗乳腺癌的活性功能，对海洋药物的开发利用具有重大意义，对新型的高效、低毒的抗癌药物的开发也具有很大的意义。 2 实验材料 、主要仪器与实验试剂 2.1 实验材料 将鱿鱼里的黑囊取出，经高速捣碎机捣碎，收取墨汁，贮藏在 -20待用。 2
10、.2 主要实验仪器 5 实验仪器 仪器名称 型号 厂家 容量瓶 10mL， 50mL， 100mL 中国医药（集团）上海化学试剂公司 量筒 10mL， 100mL， 250mL 中国医药（集团）上海化学试剂公司 圆底烧瓶 50mL， 1000mL 中国医药（集团）上海化学试剂公司 超声波清洗器 KS-80D 培养箱 DHP-9032 电子天平 JY3001 上海民侨精密科学仪器有限公司 电子天平 BS110S 北京赛多利斯天平有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DGC-9140A 上海森信实验仪器有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9053A 型 上海惊宏实验设备有限公司 恒温磁力搅拌器 85-2
11、 常州国华电器有限公司 超净工作台 SW-CJ-IBU 苏州净化设备有限公司 台式离心机 TG16-WS 长沙湘智离心机仪器公司 精密 pH 计 pHS-250 上海精密科学仪器有限公司 恒温水浴锅 SSW-420-2S 上海一恒科学仪器有限公司 低温离心机 TG16-WS 长沙湘智离心机仪器有限公司 冷冻干燥机 LGJ-18 北京松源华兴科技发展有限公司 高速冷冻离心机 CF16RX 日本 日立 海尔冰箱 BCD-215DC 青岛海尔股份有限公司 旋转蒸发仪 RE-2000A 上海亚荣生化仪器厂 倒置显微镜 日本 OLYMPUS 公司 酶标仪 美国 Bio-Rad 公司 2.3 实验试剂 实
12、验试剂 试剂名称 规格 生产厂家 甲醇 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 盐酸 化学纯 国药集团化学试剂有限公司 柠檬酸 化学纯 中国上海试剂总厂 醋酸 化学纯 国药集团化学试剂有限公司 甲醛 化学纯 国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氢氧化钠 化学纯 国药集团化学试剂有限公司 2 水磷酸氢钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 12 水磷酸氢二钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 MTT 美国 SIGMA 公司 6 3 实验方法 3.1 鱿鱼墨多肽提取工艺 将预处理过的鱿鱼墨取 10.0mL，与适量的酸提料比，在一定时间和温度下净提，最后对净提液离心得到的清
13、夜即为多肽粗品。 3.2 鱿鱼墨多肽脱脂提取工艺 将预处理过的鱿鱼墨取 10.0mL，与适量的酸提料比，再加适量丙酮，在一定时间和温度下净提，最后对净提液离心得到的清夜即为多肽粗品 7-8。 3.3 鱿鱼墨多肽酸法提取正交实验 表 1 因素水平表 水平 因素 酸的种类 酸料液比 酸解 时间 （ h） 酸解温度（ C） 1 0.01 mol/L 盐酸 1: 2 48 35 2 0.5 mol/L 柠檬酸 1:3 72 45 3 0.5 mol/L 醋酸 1:4 96 55 在 100.00ml 容量瓶中 加入 20.00g 的样品溶液， 定容 ，混匀 ， 吸取 20.00ml 置于 200.00
14、ml烧杯中，加 60.00ml 蒸馏 水 ， 在不断搅拌下用 0.05mol/L 的 NaOH 标准溶液滴定至 pH8.2，记录消耗 NaOH 的 mL 数；再加入 10.0mL 浓度为 20%的中性甲醛，混匀。用上述 NaOH 标准溶液继续滴定至 pH9.2,记录消耗 NaOH 标准溶液的 mL 数，同时取等量蒸馏水做试剂空白实验 9。 氨基 态氮 含量计算 :X=（ V1- V2） C 0.014 100/(5 V) 式中： V1 为样品稀释液在加入甲醛以后滴定至终点 (pH=9.2 )所消耗的 NaOH 标准溶液的体积； V2 为空白实验加入甲醛后滴定至终点所消耗的 NaOH 标准溶液的
15、体积； C 为 NaOH 标准溶液的浓度； 0.014 为氮的毫摩尔质量； 3.4MTT 法测定细胞增值抑制率 3.4.1 细胞培养 选取乳腺癌 SKBR3 细胞（原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存），用含 10%小牛血清的 RPMI1640 完全培养基于 5%CO2， 37培养箱中培养至对数生长期 10。 3.4.2 细胞增值抑制率的测定 采用 MTT 法进行检测。配制浓度分别为 5 mg/mL、 10 mg/mL、 15 ml/mL、 20 mg/mL、 25 mg/mL、30 mg/mL 的鱿鱼墨多肽溶液。取 对数生长期 的 细胞 制成 悬液 ， 接种至 96 孔板 ，每孔 20
16、0.00L ，于 5% CO2， 37 培养 24h,弃去培养液，加入不同浓度多肽，对照组置同环境下培养 24h， 吸弃培养液，加入 1mg/mL MTT200.00L 继续培养 4h,弃去培养液，加 DMSO150L ,震荡， 置酶联免疫检测仪 在 490 nm 测吸光度 ， 计 算细胞增殖抑制指数（ IR） ，按下列公式计算 11。 IR=(未加药组值 加药组值 )/（未加药组值 空白组值） 100% 7 3.4.3 细胞形态学观察 用洁净的盖玻片， 70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到 6 孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS 或培养液洗去残留的乙醇。 然后 种入 H1299 细胞进行
17、培养， 再加入提取物，培养 48 小时，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作 12-13。 用 HE 染色法进行染色 14。将细胞生长良好的盖玻片放入培养皿中，倒入 95%的酒精，固定 15min，用 PBS 清洗二 次，每次 1min；把盖玻片浸入苏木素染色液，染色 5 10min，再用自来水浸洗，自来水冲洗，使细胞核蓝化；把盖玻片浸入伊红染液中，染色 0.5 1min，自来水浸洗；经梯度 50% 100%酒精脱水，各 5min；把盖玻片放入二甲苯透明 3 次，各 1min，用吸水纸吸干液体；中性树胶封片 15。 4 研究结果与分析 4.1 正交实验及数据处理 实验采用酸的种
18、类 、酸提料液比、酸解时间、酸解温度 4 个因素，每个因素取 3 个水平，将处理后的鱿鱼墨置室温下，每份取 10.0mL 鱿鱼墨在不同条件下反应，结果见表 2。 表 2 影响鱿鱼 墨 多肽 提取的 L9（ 34） 实验结果分析表 实验号 因素 氨基 态氮(g/100ml) 酸的种类 酸提料液比 酸解时间 （ h） 酸解温度（） 1 0.01mol/L盐酸 1:2 48 35 0.3618 2 001 mol/L 盐酸 1:3 72 45 0.2953 3 0.01 mol/L 盐酸 1:4 96 55 0.1973 4 0.50mol/L柠檬酸 1:2 72 55 0.2693 5 0.50m
19、ol/L柠檬酸 1:3 96 35 0.2275 6 0.50mol/L柠檬酸 1:4 48 45 0.1959 7 0.5 0mol/L 醋酸 1:2 96 45 0.3144 8 0.5 0mol/L 醋酸 1:3 48 55 0.1757 9 0.50 mol/L 醋酸 1:4 72 35 0.2241 k1 0.8544 0.9455 0.7334 0.8134 k2 0.6927 0.8375 0.7887 0.8056 k3 0.7142 0.6173 0.7392 0.6423 R 0.1617 0.3288 0.0553 0.1711 8 从表 2 中的极差 R 值 可以看出，
20、影响酸法提取鱿鱼墨多肽的各因素的主次顺序为酸提 料液比 酸解温度 酸的种类 酸解时间。即酸提料液比是酸法提取鱿鱼墨多肽条件中影响最大的因素，而酸解时间的对提取鱿鱼墨多肽的影响最小。用酸法提取鱿鱼墨多肽最佳条件是 0.01 mol/L 盐酸， 酸提料液比 1： 2，酸解时间 72h，酸解温度 35C 。 4.2 鱿鱼墨多肽对 SKBR3 细胞增殖的作用 不同浓度的鱿鱼墨多肽作用于 SKBR3细胞 24h， MTT法测定其对细胞增值抑制率，结果显示鱿鱼墨多肽对 SKBR3 细胞有显著的增值抑制作用，且随着鱿鱼墨 多肽浓度的增加，抑制率逐渐升高，存在明显的剂量依赖性（见表 3，图 1）。 表 3 鱿
21、鱼墨多肽对 SKBR3 细胞的增值抑制作用 Group content（ mg/ml） OD(x s) Inhibit rate（ %） 0 0 0.227 0.018 _ 1 5mg/ml 0.197 0.019 13.223 2 10mg/ml 0.211 0.010 32.112 3 15mg/ml 0.230 0.009 44.659 4 20mg/ml 0.199 0,010 56.379 5 25mg/ml 0.223 0.018 64.550 6 30mg/ml 0.224 0.020 77.225 鱿鱼墨多肽对SKB R3细 胞增长的抑制率0.0020.0040.0060.0080.00100.00120.005 10 15 20 25 30content(mg/ml)Inhibit rate(%)图 1 鱿鱼墨多肽对 SKBR3 细胞增殖抑制的量效关系 9 4.3 HE 染色观察 SKBR3 细胞形态 显微镜下观察，对照组细胞呈多边形，细胞核大小不一，呈圆形或卵圆型，核分裂相多，核仁数目多，核浆比例高。鱿鱼墨多肽作用后可见细胞形态不规则，异型性明显，部分细胞质出现大小数目不等的空白，核 仁数目减少，细胞轮廓模糊，细胞质碱性降低，巨核细胞增多，染色质凝聚，核固缩 (图 2)。 A B
