1、 本科毕业论文 （ 20 届） 三株鳖源致病性嗜水气单胞菌对温度、盐度和酸碱度的耐受特征 所在学院 专业班级 海洋渔业科学与技术 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 2 目录 中文摘要 3 英文摘要 4 1.前言 5 2.材料与方法 7 2.1 试验材料 7 2.2 试验方法 7 3.结果 9 3.1 数 据 9 3.2 数据结果 15 4.讨论 15 5.建议 16 致谢 16 参考文献 17 3 三株鳖源致病性嗜水气单胞菌对温度、盐度和酸碱度的耐受特征 摘 要 以三株分离自中华鳖体内的致病性嗜水气单胞菌 ZHYYZ-2 、 ZHYYZ-3、 ZHYYZ-4为研究对象，连续监测
2、实验菌 24h 生长周期内对所设温度、盐度、 pH 的耐受情况。通过 24小时不断地观察在 温度： 4、 10、 20、 30、 35、 40；盐度： 5， 15， 25， 35， 45， 50； pH 值： 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 的恒定情况下对嗜水气单胞菌进行观测并同分光光度计记录数据，通过得到的数据描绘出各个因子下嗜水气单胞菌的生长标准曲线，比较与分析各条曲线来测定其生长情况。试验结果分析表明：在温度 20 35情况下致病性嗜水气单胞菌 ZHYYZ-2， ZHYYZ-3 ， ZHYYZ-4 均迅速生长，温度其他温度情况下均受到不同程度的抑制，低温下条件下几乎不生长。在盐
3、度 0.5%时， 3 株细菌均生长较快，吸光度上升迅速，稳定后，达到最高值，其他盐度下，均受到抑制。在不同的 pH 培养基中， 3 株细菌在 pH 在6-8 的时候生长很快，其他情况都受到抑制，弱碱和弱酸都适合该 3 株细菌生长，强酸和强碱都不适合该 3 株细菌生长。 关键词 嗜水气单胞菌 温度 盐度 酸碱 吸光度 生长 4 Abstract Three strains isolated from patients with white shell disease pathogenicity in vivo turtle Aeromonas hydrophila ZHYYZ-2, ZHYYZ-
4、3, ZHYYZ-4 as the research object, 24h continuous monitoring of experimental strains of the growth cycle set temperature, salinity, pH tolerance situation. 24 hours of continuous observation by the temperature: 4 , 10 , 20 , 30 , 35 , 40 ; salinity: 5 , 15 , 25 , 35 , 45 , 50 ; PH value : 4,5,6,7,8,
5、9,10 under constant conditions of Aeromonas hydrophila were observed and recorded with the spectrometer data, depicted by the data obtained under the various factors of Aeromonas hydrophila standard curve of growth compared with the analysis of the curve to determine its growth. The results showed t
6、hat: the temperature of 20 35 case of pathogenic Aeromonas hydrophila ZHYYZ-2, ZHYYZ-3, ZHYYZ-4 are rapidly growing, the temperature under other temperature conditions are subject to different degrees of inhibition, under the conditions of low temperature almost no growth. 0.5% salinity, the three b
7、acterial growth quickly, the absorbance increased rapidly and stabilized, the highest value, other salinity, were inhibited. PH in a different medium, the 3 strains in the PH when growing rapidly in the 6-8, the other conditions are suppressed, weak base and weak acid are suitable for the three bact
8、erial growth, acid and alkali are not suitable for the 3 strains of bacterial growth. Key words Aeromonas hydrophila, salinity, temperature, absorbance of the growth of acid-base 5 1. 前 言 嗜水气单胞菌广泛存在于自然界的湖泊、河流等水体中，它是许多水生动物的原发性致病菌，当该种细菌形成爆发性流行时，容易造成淡水养殖容易造成极大的损害。 嗜水气单胞菌（ Aeromonas hydrophila）属于弧菌科 (Vi
9、brionaceae)气单胞菌属(Aeromonas) ，气单胞菌属根据有无运动力可分为两类；一类是嗜冷性、非运动性的气单胞菌，另一类为嗜温性、运动性的气单胞菌。嗜水气单胞菌属第二类，在气单胞菌属中是最重要的，它是气单胞菌属的模式菌，可分为嗜水亚种、不产气亚种和解氨亚种，两端钝圆，直或略 弯，单个或成双排列，无荚膜，无芽孢 1。 嗜水气单胞菌呈短杆状，两端钝圆，直形或略弯，有时也可呈双球状或丝状，革兰氏阴性菌，无荚膜，但在特殊培养条件下有荚膜产生2，无芽孢，单个或成双存在，大小为 0.3 1.0m 1.0 3.5m 。电子显微镜下可见极生单鞭毛，部分具有侧鞭毛，具运动力 3。 嗜水气单胞菌在自
10、然界中广泛分布 4， 普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类的粪便中，有致病性菌株和非致病性菌株之分，致病性菌株可感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类等动物，临床上以急性出血性败血症 5为主要特 征，慢性感染则主要表现为皮肤溃疡或肠炎。人类亦可因致病性单胞菌的感染而发生腹泻及食物中毒，是一种典型的人、兽、鱼共患病病原菌 6， 7。中华鳖的赤斑病、疖疮、红脖子并发症 , 是一种严重危害鳖的暴发性传染病 ,可达 20% 30% 以上的死亡率。其外部主要症状为四肢基部及背腹甲出现疖疮 , 内有米状物 , 严重者疖疮溃烂成洞穴 ; 颈脖红肿充血 , 伸缩困难 ; 腹甲出现多个大小不一的红斑 , 并逐
11、渐溃烂。孙其焕和肖克宇 1988 , 杨臣和曹生福 1988 , 肖克宇等 1991 , 孙佩芳等 1996 , 杨广等 1998 分别对鳖的赤斑病、红脖子病、疖疮病、穿孔病和红底板病的病原进行了初步研究 , 其病原均为嗜水气单胞菌 8。 总体而言，欧美等西方国家对人源气单胞菌的研究较多，而中国、东南亚诸国等传统的水产养殖大国则更注重该菌对养殖鱼类的危害 9。由该菌引发的败血症东南亚国家通常称之为流行性溃疡败血综合征（ epizootic ulcerative syndrome,EUS） ，中国大陆则将该类疾病称为暴发性流行病 10。由嗜水气单胞菌感染的疾病一般病势较猛，为条件致病菌，当环境骤
12、变，水质恶化时， 常会与其它菌（如温和产气单胞菌、弧菌等）混合感染使病情加重，多为恶性传染病，死亡率很高 11。注射该菌引起稚鳖感染与致死具明显的剂量 时间效应 , 随注射菌量递增依次出现不表露临床感染症状、表露临床感染症状而不出现死亡和大量死亡三种情形 , 稚鳖表露临床感染和出现死亡的时间均随注射菌量增大而明显缩短 , 绝大多数稚鳖表露临床感染和出现死亡的时限分别为 2h 和 48h12。及早发现这些病菌，可以争取时间做好防治工作。 嗜水气单胞菌的致病性主要通过其本身所特有的毒力基因所致，包括粘附素 (adhesins，Aha) 、侵袭素 (invasions) 、肠毒素 (enteroto
13、xins) 、溶血素 (hemolysin， AHH) 、气溶素 (aerolysin， AerA) 、外膜蛋白 (outermembrane p roteins， OMP)等 ， 这些毒力基因在细菌的致病性中起重要作用 13， 14。根据条件致病菌 15（ (1) 具备致病的分子基础是决定是否为致病菌的首要前提 ; (2) 任何细菌均有适宜其生存和繁衍的生态幅 , 研究表明只有适宜的温度才可使致病菌表达并释放关键性毒力因子 (胡靖等 , 2006), 并表现出强致病力 (杨先乐等 , 1999; 胡靖等 , 2006), 高 pH 不利于毒素的产生 (Tsai et al, 1997; 胡靖
14、等 , 2006), 6 故认为致病菌都是条件性致病的 , 这与杨先乐等 (1999)指出除了菌株本身能产生多种毒力因子的内因外 , 其外界环境条件也是不容忽视的因素的观点相一致 ;(3) 基于自然水域生态要素的复杂性 , 水生经济动物疾病的发生与传播往往是多种因子综合作用的结果 ,种间干扰等生物因素也可能会对嗜水气单胞菌的致病力产生影响。）可以得知外界环境对于嗜水气单胞菌的毒力表达有重大的影响。 根据 PCR 纯 化产物测序所获 16S rDNA 相关信息 , 经 Blast 同源性检索表明它们与GenBank 数据库中登记的 71 株嗜水气单胞菌 16S rDNA 序列的相似性均为 99%
15、16。 实验菌 16S rDNA 有关信息 实验菌在透射电镜下形态 b: ZHYYZ-2 c: ZHYYZ-3 d: ZHYYZ-4 实验菌菌体规格、菌落表观及 -溶血环直径间的比较 7 毒力基因是嗜水气单胞菌引起致病性的重要因素，温度，盐度， PH 值对嗜水气单胞菌的基因表达有很大的影响。研究这些因素可以帮助我们寻找控制这种致病菌生长的办法，从而减少水生动物感染几率。 本课题试验利用分光光度计的比色法（是研究细菌生长状况的常用方法，在各种细菌研究中都已经得到广泛的应用，是一种公认的方法）分析原理对不同耐受特征培养后的嗜水气单胞菌进行吸光度检测，最后得到该特征和菌株生长之间的关系。 2.材料和
16、方法 2.1 试验材料 2.1.1 菌种 （ 1）本试验所采用的嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌 ZHYYZ-2（ Gu563993）， ZHYYZ-3（ Gu563994）， ZHYYZ-4（ Gu563995），该于 2009 年由浙江海洋学院分离鉴定并提供。 （ 2） 培养基：营养肉 汤培养基 杭州微生试剂物有限公司。 （ 3） 试验设备 （ 1）万用电热炉：用于加热配制培养基及移液管的消毒 .功率 500 1000W，电压 220V -嘉兴市欣欣仪器设备有限公司生产 。 （ 2）立式自动电热压力蒸汽灭菌干燥器：用于对培养基和烧杯等的消毒。型号 LD40SAI，功率 3.5KW，电源电压 22
17、0V，额定工作压力： 0.14 0.165MPa （ 3）数显电热鼓风干燥箱：用于干燥试管、烧杯等电源 220V，电热功率 5KW，温度范围室温 300，灵敏度 1。 （ 4）生化培养箱：用于高压蒸汽灭菌，型号 SHP 250，额定功率 0.9KW，温度调节范围 10 40 -上海实验仪器厂有限公司生产。 （ 5）双人单面净化操作台： 用于接种时防止感染杂菌。 洁净度： 0.5m，尘埃粒径 3.5 颗（百级），风速： 0.3 0.6m/s（手调），噪单： 62dB（ A），电源： 50HZ/220V-苏州净化仪器设备有限公司生产 。 （ 6）可见分光光度计：用于测量细菌培养液的吸光度，型号 7
18、22S，波长范围 3351000nm，波长准确度 2nm，广度准确度 0.5%（ T），精度 0.001， -上海恒平科学仪器有限公司生产。 （ 7） pH 计：型号 PB-20，精度 0.01，用于测量细菌培养液的 PH 值。 （ 8）其他设备： 胶头滴管， 15ml 试管， 1ml、 5ml 吸管，移液管，试管架，接种枪，贴标纸，干燥箱，培养皿，烧杯，量筒，玻璃棒，接种环，酒精灯。 2.2 试验方法 8 2.2.1 细菌培养 试验采用肉汤培养液作培养基进行细菌培养，标准 pH 为 7.0，标准盐度为 5，标准温度为 30。预先将三株嗜水气单胞菌接种到肉汤培养基中，培养 18 小时备用。 2
19、.2.2 培养基制备 肉汤培养基按说明书标准配备。 2. 2.3 培养条件的控制 温度的控制：恒温培 养箱温度设置为 30，冰箱温度设置为 4，其他温度由不同温度的水浴锅控制；盐度控制通过调整培养基中 Nac l 的含量来控制，细菌培养温度均为 30； PH值的控制通过向培养基中滴加 1%的盐酸溶液或 1% NaOH 实现，并用 PH计测定，试验培养温度为 30。 1)温度试验： 温度分别为 4、 10、 20、 30、 35、 40； 每个温度下需要在 13 个时间点（ 24小时内，每隔 2小时进行一次）进行测量，每个时间点分别测量 3次，需要的试管数为 6X13=78支，并且每一支试管内的
20、菌液用分光光度计分别测量 3 次，求取平均值 . 试验所选用的试管规格为 15ml，每支试管盛肉汤培养液 5ml，需要制备肉汤培养液78X5=390ml，为防止试管意外损坏，试验多备 60 支试管和肉膏汤培养液 450ml，用移液管和吸耳球将原制备的肉汤培养液按每支 /5ml 转移到试管中，转移完后用试管塞塞紧，然后分 6 组进行高压灭菌（高压蒸汽灭菌锅），灭菌后转移到双人无菌操作台备用。 另由于用分光光度计测量时要以未接种的肉膏汤培养液调零，故单独再配制肉汤培养液65ml 及 15ml 试管 13支，将肉汤培养液用移液管和吸耳球转移到试管中并塞紧，与试验试管高压灭菌，灭菌后移至无 菌操作台备
21、用。 2)盐度试验： 盐度的设置： 5， 15， 25， 35， 45， 50；每个盐度下分 13 个时间点（ 24 小时，每隔 2小时进行一次）测量，试验温度都设置在 30，培养基 pH 值为 7. 每个时间点分别测量 3次，所以需要的试管数量为 6X13=78 支，并且每支试管内的菌液分别用分光光度计测量 3次，最后求取平均值 .并配 13 支培养基用于肉膏汤培养液调零。 3） pH 试验： pH 的设置： 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10。 pH值的控制通过向培养基中滴加 1%的盐酸溶液或 1% NaOH 实现，并用 PH 计测定，实验培养温度为 30。每个 pH 下分 13 个
22、时间点（ 24 小时，每隔 2 小时进行一次）测量，试验的 1 温度是 30，盐度设置在 5（培养基的原始盐度是 5，如果淡化，将会和其他组的培养基标浓度不一致故设置为 5）。 4)试验菌接种 ： 分别取培养好的种子液 0.3ml 用接种枪依次注入各培养管，每个梯度设置三个平行，并用普通营养肉汤培养基做对照。 嗜水气单胞菌的试验培养基的配置方法和温度，盐度， PH 设置和试验接种浓度同上。 5)数据测定： （ 1）将可见分光光度计的波长调至 550nm，开机预热 15-20 分钟。 （ 2）从 0h 开始测量，至 24h 结束 ，每隔 2 个小时在 10 个盐度的试验组中各取出一支试管，9 测
23、出每支试管中培养液的吸光度，重复测量三次，记录下测量的结果，各组方法一致。 3结果： 3.1 数据： 测试数据表 3-1 ZHYYZ-4 /ZHYYZ-3/ ZHYYZ-2 吸光值（ 波长 550nm,对照组数值均为 0.000） ZHYYZ-4/温度 4 10 20 30 35 40 时间 /h 0 0.001a0.000 0.001a0.000 0.001a0.000 0.001a0.000 0.001a0.000 0.001a0.000 2 0.037ae0.006 0.021bcdef0.009 0.013cdef0.010 0.014def0.008 0.027ef0.011 0.0
24、18f0.011 4 0.036abcdf 0.012 0.023bcdf 0.002 0.010cdf0.010 0.040df0.004 0.164e0.054 0.048f0.005 6 0.031abc 0.004 0.029bc 0.024 0.015c0.003 0.175df0.008 0.340e0.006 0.181f0.007 8 0.032ab0.017 0.045b0.003 0.108c0.009 0.360d0.006 0.390e0.008 0.289f0.010 10 0.025ab0.003 0.021b0.005 0.260c0.017 0.445d0.02
25、3 0.432e0.011 0.322f0.011 12 0.056a0.003 0.030b0.004 0.340c0.003 0.429de0.014 0.422e0.007 0.305f0.016 14 0.031ab0.004 0.028b0.001 0.404c0.004 0.447de0.010 0.446e0.007 0.300f0.002 16 0.027ab0.001 0.024b0.002 0.445c0.009 0.482d0.003 0.460e0.011 0.301f0.007 18 0.065ab0.007 0.044b0.009 0.452cd 0.010 0.4
26、61d0.008 0.513e0.010 0.303f0.009 20 0.030ab0.006 0.016b0.004 0.475cd0.013 0.487d0.015 0.518e0.011 0.318f0.008 22 0.055a0.003 0.019b0.005 0.493c0.006 0.512d0.005 0.524e0.011 0.304f0.003 24 0.027a 0.000 0.003b0.000 0.526cd 0.006 0.530d0.009 0.554e0.010 0.325f0.013 ZHYYZ-3 0 0.001a 0.001a 0.001a 0.001a
27、 0.001a 0.001a 2 0.055a0.003 0.035bc0.001 0.029c0.005 0.017d0.001 0.145e0.015 0.080f0.005 4 0.016abc 0.004 0.017bc0.002 0.007c0.006 0.144d0.006 0.364e0.015 0.256f0.008 6 0.015ab0.022 0.003b0.001 0.104c0.010 0.374df0.006 0.404e0.004 0.357f0.018 8 0.005ab 0.006b 0.204c 0.428d 0.404e 0.348f10 0.006 0.0
28、04 0.004 0.004 0.004 0.003 10 0.016a0.004 0.001b0.001 0.331cf0.013 0.421de0.009 0.416e0.008 0.342f0.003 12 0.011ab0.003 0.003b0.001 0.422cd0.012 0.435de0.017 0.440e0.004 0.343f0.002 14 0.005a0.004 0.038b0.006 0.456ce0.004 0.441d0.008 0.460e0.008 0.350f0.005 16 0.016a0.005 0.039b0.005 0.462ce0.007 0.
29、445de0.009 0.450e0.012 0.347f0.003 18 0.002a0.002 0.080b0.008 0.480cde0.004 0.484de0.007 0.477e0.010 0.364f0.002 20 0.015a0.003 0.123b0.002 0.486cd0.013 0.490d0.009 0.517e0.014 0.384f0.007 22 0.008a0.004 0.149b0.007 0.500cd0.018 0.506d0.006 0.533e0.002 0.385f0.011 24 0.023a0.002 0.159b0.007 0.497c0.
30、005 0.519d0.015 0.543e0.004 0.378f0.009 ZHYYZ-2 0 0.001a0.000 0.001a0.000 0.001a0.000 0.001a0.000 0.001a0.000 0.001a0.000 2 0.005ab0.003 0.011bc0.001 0.024cd0.003 0.033d0.018 0.107e0.012 0.058f0.006 4 0.002ab0.002 0.005b0.006 0.029c0.011 0.146d0.006 0.302e0.006 0.233f0.011 6 0.005ab0.004 0.001b0.001
31、 0.109c0.002 0.333d0.010 0.361e0.004 0.280f0.007 8 0.006ab0.005 0.006b0.005 0.223c0.011 0.388d0.003 0.412e0.017 0.347f0.013 10 0.006ab0.005 0.005b0.003 0.263c0.003 0.410de0.008 0.419e0.012 0.370f0.008 12 0.025ab0.003 0.009b0.007 0.334c0.013 0.395d0.010 0.416e0.011 0.356f0.012 14 0.026a0.004 0.004b0.
32、005 0.412cd0.006 0.409d0.007 0.470e0.009 0.347f0.003 16 0.019a0.002 0.030b0.002 0.452cd0.003 0.458d0.003 0.485e0.011 0.380f0.007 18 0.019ab0.006 0.008b0.006 0.456c0.014 0.482d0.006 0.475e0.012 0.351f0.005 20 0.031a0.004 0.016b0.004 0.463c0.002 0.501de0.012 0.483e0.004 0.350f0.009 22 0.006a0.005 0.047b0.009 0.477c0.012 0.533d0.010 0.502e0.009 0.384f0.016 24 0.001a0.001 0.082b0.002 0.513c0.011 0.567de0.014 0.547e0.023 0.408f0.024
