1、HPLC 法测定蓝莓中鞣花酸含量摘要:目的建立蓝莓提取物中鞣花酸含量的 HPLC测定方法。方法色谱条件ODS HYPERSIL C18柱(100mm 4.6mm, 5m),柱温40,用CH3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4(0.05mol/L)(体积比44254)作为流动相,检测波长为 254nm。结果鞣花酸在0.318318.0g范围内与峰面积呈良好的线性关系,r=0.99902。平均加样回收率为95.42%,RSD为1.03%。结论本方法精确可靠。关键词:蓝莓;鞣花酸; HPLCDetermination of ellagic acid in the extracts of L
2、blueraspberry by HPLCLIUYAN1 SONG Li-qiu1 FAN Jun-juan2 LIU Huna-yu2(1Standard Information Research Institute of Shenyang Quality and Technical Supervision Bureau,Shenyang110161；2 Liaoning Agricultural Vocation-Technical College，Yingkou115009)Abstract：To develop a rapid and sensitive high-performanc
3、e liquid chromatographic assay for determination of ellagic acid in the extracts of L blue raspberry. Method Chromatography was performed on a ODS HYPERSIL - C18 column (250 mm 4. 6 mm,5m) at 254 nm. The mobile phase consisted of a mixture of methanol, ethyl acetate, 0.05 mol/L KH2 PO4 - H3 PO4 (442
4、54) at a flow rate of 1.0 ml/min. Result and Conclusion The linear range of ellagic acid was 0. 318 - 318. 0g with a correlation coefficient of 0. 99902. The average recovery was 95.42% and RSD 1.03%. The method is accurate and reproducible Key words: L blue raspberry. ; ellagic acid; HPLC蓝莓为多年生落叶或长
5、绿果树，是一种具有极高经济价值的新兴世界性小浆果果树，是越桔属植物中营养成分最丰富的类型，被联合国粮农组织（FAO）确定为人类五大健康食品之一。果实中大多含有特别丰富的、有益于健康的氨基酸、蛋白质、脂肪、碳水化合物、叶酸、鞣花酸、鞣花单宁、丰富的食用纤维、果糖、维生素、维生素、维生素、熊果甙、花青甙、类黄酮及钾、铁、锌、锰等微量元素。现已成为保健食品的良好原料。随着我国人民生活水平的不断提高，对保健食品的要求和希望越来越高，因此，加速蓝莓的发展有着广阔的前景，它将会成为21世纪的另一个新兴产业。鞣花酸是广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的一种天然多酚组分,它是没食子酸的二聚衍生物,是一种多酚
6、二内酯 1。它不仅能以游离的形式存在,而且更多的是以缩合形式(如鞣花单宁、苷等)存在于自然界。鞣花酸对化学物质诱导癌变及其它多种癌变有明显的抑制作用，具有抵抗肺癌、食管癌 2,抗氧化 3等作用。从机理上讲，它是一种抗氧化剂，能与人体内有害自由基结合，具有强力去癌变功效，可抗衰老、增加肌体免疫力；具有凝血 4、降压、镇静作用 5，对多种细菌、病毒有很好的抑制作用 6；最新研究发现鞣花酸有抑制酪氨酸酶过剩的作用，从而使导致皮肤雀斑、黄褐斑形成的黑色素难以形成，达到美白皮肤的效果。目前,国外正在开发以鞣花酸为原料的保健食品与药物。本文建立了HPLC法测定蓝莓中鞣花酸含量的方法,并对文献报道的多种色谱
7、条件进行了比较,表明本文方法精确可行。1.实验部分1.1 实验材料蓝莓试材取自于内蒙古牙克石市伊图里河镇(大兴安岭)1.2 仪器与设备Agilent hp 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司) ；Kudos SK5200H 型超声仪(上海科导)；DF 200A 200/0.1mg电子天平（德国赛多利斯股份公司） ；U FENG型真空抽滤机；C18固相萃取柱（上海安谱科技有限公司） ；R-205旋转蒸发仪等（瑞士Buchi） 。1.3 试剂和溶液1.3.1 试剂鞣花酸标准品（纯度96%） ，美国 sigma 公司生产。色谱纯：乙酸乙酯、甲醇（国药集团化学试剂有限公司） 。分析纯：丙酮（北京化
8、学试剂公司） 、盐酸（沈阳市东兴试剂厂） 、二甲亚砜（沈阳市东兴试剂厂） 、磷酸（北京化学试剂公司） 、磷酸二氢钾（北京化学试剂公司） 。配置试剂均用去离子水。1.3.2 溶液鞣花酸对照品溶液：精密称取鞣花酸对照品15.92 mg,置50 mL量瓶中,用二甲亚砜溶解并稀释至刻度,摇匀。经0.4 5m的微孔滤膜滤过,制成每1 mL含0.3184 mg的溶液,作为对照品溶液。0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液：称取 1.56g（精确到 0.01g）磷酸二氢钾溶于磷酸中，定容到 100ml，经微孔滤膜（0.45m）过滤，备用。1.4 样品处理 精密称取蓝莓浆约0.6g,加70%丙酮100mL,浸渍约
9、6h,超声处理30 min,滤过,残渣用70% 丙酮30 mL洗涤,合并70%丙酮滤液和洗涤液 ,用旋转蒸发仪蒸干丙酮溶液 ,加50% 的甲醇溶液100 mL(内含1.2 mol /L 的盐酸 ,及0. 2g维生素C) ,90回流 ,再用旋转蒸发仪浓缩至干，残渣用二甲亚砜溶解,定容于100mL 量瓶中。精密吸取10mL 于 50mL量瓶中,用二甲亚砜定容, 0. 45m的微孔滤膜滤过,作为供试品溶液 7。1.5 液相色谱分离条件色谱柱：ODS HYPERSIL C18 (100mm46mm 5)；流速： 1.0mLmin；柱温40；检测波长：254nm；进样量： 10L；流动相：流动相为CH
10、3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4(0.05mol/L) (体积比44254)。1.6 标准曲线准确称取一定量的鞣花酸标准品，加二甲亚砜溶解并稀释定容，配制成鞣花酸的质量浓度为0.318，3.18，63.6，159.0，318.0ug/mL的工作溶液，用滤膜过滤，分别取10l 供高效液相色谱分析。每个浓度点进样3针。以色谱峰面积对鞣花酸的质量浓度作图，得到鞣花酸的标准曲线。1.7 回收率和重复性试验称取约 0.6g 匀浆后的蓝莓浆样品，分别向其中加入一定量的鞣花酸标准溶液，然后再进行浸渍、超声提取、过滤洗涤、浓缩以及高效液相色谱分析。2.结果与分析2.1 结果2.1.1 标准曲线以鞣
11、花酸的色谱峰面积(A) 对进样前鞣花酸的质量浓度 (C，g/mL )作图，得到其标准曲线。线性回归方程为：A112143.804C+285.00109，线性相关系数为0.99902。鞣花酸量在0. 318318.0g/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。2.1.2 试样测定结果经过以上试验确定了最佳的色谱条件。在上述色谱条件下测得鞣花酸标准品色谱峰如图 1 所示，蓝莓样品经过提取、分离后的色谱图见图 3 所示。从图 2 中可以看到鞣花酸的保留时间大约为 5.959min，而蓝莓样品提取液经过预处理和净化后的色谱图中该处干扰组分峰基本分离（如图 2 所示） ，不会影响鞣花酸含量的测定。图 1 31
12、8.4ug/mL 鞣花酸标准品色谱图Fig.1 Chromatograms of the derivatives of 0.3184mg/mL ellagic acid stangard 图2 蓝莓样品色谱图Fig 2 Chromatograms of blue raspberry sample2.1.3 回收率和检出限 取已知含量的样品共6份,每份约0.6g,精密称定,分别加入鞣花酸对照品约25mg,按供试品溶液制备方法制备成加样供试品溶液,测定含量,计算平均回收率为95.42% , RSD为1.03% 。不同蓝莓组织中不同浓度鞣花酸的加标回收率均在90.34一97.38，其多次测定的RSD
13、均小于2，其回收率和RSD符合分析的要求。2.1.5 精密度试验精密吸取同一对照品溶液10L,连续重复进样6次,测定鞣花酸的峰面积值,结果RSD为0.79% ,表明精密度良好;取同一供试品溶液,连续重复进样6 次,测定鞣花酸的峰面积值,结果RSD 为 0.67% ,表明精密度良好。2.1.6 重现性实验取同一样品 6 份，分别按供试品溶液制备法制备，测定其鞣花酸峰面积，计算，样品中鞣花酸平均含量为 6.893mg/g，RSD 为 1.03%，表明样品处理过程和测定方法均有良好的重现性。样品峰2.1.7 试样测定结果取3批提取物,按上述供试品溶液制备方法及色谱条件进行测定,以外标法计算含量,结果
14、见表1。表1 蓝莓中鞣花酸含量Tab. 1 Content of ellagic acid in blue raspberry样品 鞣花酸 (mgg- 1 )（n=3 ） RSD /%样品1 5.748 0.98样品2 7.628 0.99样品3 7.304 1.122.2 讨论2.2.1流动相组成及配比影响被分析物的分离效果。本试验通过改变流动相的组成及配比，发现使用CH 3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4(0.05mol/L) 为流动相其体积比为44254时，鞣花酸与其它成分能够完全分离。因此本实验选择流动相的组成及配比为CH 3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4(0.0
15、5mol/L)（体积比为44254） 。2.2.2鞣花酸的含量测定方法较多 8 ,但用HPLC法测定蓝莓中鞣花酸含量未见报道,本文首次建立了蓝莓中鞣花酸的含量测定方法。2.2.3 本研究表明 ,蓝莓水解液中鞣花酸的含量较高(约为6% ) ,可进一步研究提取分离工艺,以从蓝莓中获得大量的天然鞣花酸,作为医药、保健品、化妆品及科研的原料。鞣花酸在医药、保健品、化妆品等方面应用比较普遍。随着人们生活水平的提高，对天然植物资源的开发与利用日益迫切，因此鞣花酸的开发及合理使用是迫在眉睫需要解决的问题。本人对鞣花酸的提取及含量检测方法进行了探究与优化，可以在较短时间内对生物样品中鞣花酸进行提取并准确的定量
16、，还将有待于进一步的研究。参考文献1Angelika R ,Ronald E W , Ellagic acid content of red raspberry juice as influenced by cultivar ,processing ,and environmental factors , J . A gric. Food Chem. , 1993 , 41 : 1951 19602 Stoner GD, Morse MA. Isocyanates and p lant polyphenols as inhibitors of lung and esophageal cance
17、r J . Cancer Letters,1997, 114: 113. 3 Kalt W, Forney CF, Martin A, et al. Antioxidant capacity,vitamine C, phenolics, and anthocyanins after storage of small fruits J . Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999,47: 46834 Takuo K, Ishida H ,Yokota M et al . Studies on antihemorrhagic substanc
18、es in herbs classified as hemostatics in Chinese medicine on the antihemorrhagic principle in sanguisorba officinallis L , Chem Pharm. B ull . , 1984 , 32 : 447844815Damas J ,Remade V G,Ther thrombopenic effect of ellagic acid in the rat ,another model of platelet stimulation in vivo , Thromn. Res.
19、,1987 ,45 :1531636Chemeng K A ,Schwender C F ,Fu K P et al . DNA gyrase inhibitory and antibacterial activity of some flavones (1) , Bioorg. Med. Chem. Lett . ,1993 ,3 (2) :2252307 周本宏,吴振华,刘春，等.高效液相色谱法测定石榴皮中鞣花酸的含量J. 广东药学院学报，2005, 6(21):693-694. 8 晋艳曦. 葡萄汁中鞣花酸的定性与定量分析 J . 饮料工业,1999, 2 (5) : 33.作者与通讯作
20、者简介：刘艳(1974-)，女，1974年2月18日出生，硕士研究生，内蒙古人，工程师，从事分析及信息标准化研究。论文英文标题：Determination of ellagic acid in the extracts of L blue raspberry by HPLCLIUYAN1 SONG Li-qiu1 FAN Jun-juan2 LIU Huna-yu2手机号码：13889895511 E-mail：。通讯地址：沈阳市质量技术监督局标准信息研究院标准化研究室 邮编：110021江苏农业科学编辑部您好：本论文已经按照您们的要求更改完毕，图片是仪器走完样后直接复制的，是不可更改的原图，但横纵坐标都有，横坐标为分钟，纵坐标为仪器响应值。
