1、iTRAQ 技术简述1. 研究背景1994 年，Marc Wilkins 在 Siena 双向凝胶电泳（two-dimensional electropho- resis， 2-DE）会议上最早提出了蛋白质组（proteome ）概念，并于 1995 年 7 月的 Electrophoresis 杂志上发表。随着高通量、高灵敏度、高分辨率生物质谱技术的出现，蛋白质组学技术取得飞速发展，人们不再满足于对一个细胞或组织的蛋白质进行定性研究，而是着眼于蛋白质量的研究，于是蛋白质组学概念就被提出，并得到了广泛的应用。蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质（protein ）与 基因组学（genom
2、ics）两个词的组合体，表示“ 一种基因组所表达的全套蛋白质” ，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学研究，就是要把一个基因组表达的绝大多数蛋白质或一个复杂的混合体系中绝大多数蛋白质进行精确的定量和鉴定。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学是一门以全面的蛋白质性质研究为基础，在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学。目前最新的 iTRAQ 蛋白定量分析技术在此基础上被提出，并被得到广泛应用。仅仅知道蛋
3、白质的身份并不足以对蛋白质给出最终定论，因为蛋白质的浓度对于实现其在细胞中的功能来说极其重要，一种特殊蛋白质在浓度上的变化，就能预示细胞的突变过程。因此，科学家能够对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量，是很重要的事情。过去，科学家通常先进行二维(2D)凝较电泳，切断条带，再用质谱方法测量条带中的蛋白质。可是，这种方法不是很理想：既不是非常敏感，也不是非常精确。新泽西医学及牙科大学的蛋白组学研究中心主任 Hong Li 说：“ 当我们开始蛋白组学研究时，就采用 2D 凝胶技术，但得出的信息量却让大伙很失望，因为许多蛋白质已经改变了自身的代谢过程，如热休克蛋白或者是管家蛋白。”蛋白组学中的方法一直在不
4、断提高。基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果。定量蛋白组学是蛋白质组学的一个重要组成部分，即对一对基因组表达的全体蛋白或一复杂的混合物体系中所有蛋白质进行定量和鉴定。常用的定量蛋白质组学的研究方法包括 DIGE（difference gel electrophoresis ）、iCAT（Isotope-coded affinity tag）和 SILAC(Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Cultures)。 iTRAQ（isobaric tags for relative and
5、 absolute quantitation）是美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004 年新开发的一项蛋白定量技术。iTRAQ 和 iCAT 是这些新进展中的两大主力，但是，新技术也有不尽如人意的地方，需要不断改进。2. iTRAQ 技术介绍2.1 技术简介iTRAQ 技术是一种新的、功能强大的可同时对四种样品进行绝对和相对定量研究的方法，这种方法是建立在 iTRAQ 试剂的基础上。 iTRAQ 实际上是一种同位素标记试剂，包括一个带电荷的报告基团，报告基团有 4 种相对分子质量分别为 114、115、116 和 117，另外还
6、有一个肽段反应基团和一个平衡基团，平衡基团也有 4 种相对分子量分别为 31、30、29 和 28。其中平衡基团平衡分子量，保证与每一种报告基因结合后 iTRAQ 试剂总的相对分子量都是 145，肽段反应基团可以同肽段的 N 末端和赖氨酸测量 E 氨基基团发生反应，这样可以标记生物样品中产生的所有肽段，增强任一给定蛋白的肽段覆盖度，同时保留了诸如一些蛋白的翻译后修饰的重要结构信息。2.2 技术特点该技术的主要特点在于：1.分离能力强、分析范围广；2.定性分析结果可靠，可同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息；3.MS 具备高灵敏度、检测限低；4.分析时间快，分离效果好；5.自动化程度高；6
7、.iTRAQ 技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。iTRAQ 技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于 10KD 或大于 200KD 的蛋白。常用的液相色谱仪是型号是日本岛津公司 2D-nano-HPLC，质谱仪型号是美国 ABI 公司的 MALDI-TOF-TOF 4700，标记试剂盒是美国 ABI 公司的ITRAQ 标记试剂盒。所采用的 iTRAQ 试剂是一种小分子同重元素化学物质，包括三部分：一端是报告部分（reporter group ），另一端是肽反应部分（peptide reactive group），中间部分是平衡部分（balance group）。 其中，re
8、porter group：质量为 114Da、115 Da、116 Da、 117 Da，因此 iTRAQ 试剂共四种。 peptide reactive group：将 reporter group 与肽 N 端及赖氨酸侧链连接，几乎可以标记样本中所有蛋白质。 balance group：质量为 31 Da、30 Da 、29 Da、28 Da，使得四种 iTRAQ 试剂分子量均为 145 Da，保证 iTRAQ 标记的同一肽段 m/z 相同。2.2 操作流程iTRAQ 的操作程序如下：将蛋白质裂解为肽段，然后用 iTRAQ 试剂进行差异标记。再将标记的样本相混合，这样就可以对其进行比较。与
9、样本结合后，通常用 MudPIT 多维蛋白质鉴定技术进行下一步的操作，用 2D 液相色谱串联质谱进行分析。在质谱分析鉴定特殊肽离子片断结构的基础上，采用美国应用生物系统公司的软件包MASCOT 和 Protein Pilot 对每一个肽段进行鉴定。其具体操作如下图所示：iTRAQ 技术对检测标本也有一定要求。它要求检测蛋白量最低不少于50ug，浓度最低不少于 5ug/uL，否则同位素无法标记。而对蛋白提取试剂也要求使用普通的组织、细胞裂解液即可，切忌不要使用二维电泳试剂提取。2.3 技术优势iTRAQ 技术区别与以往二维电泳技术具有更明显的优势，两者比较如下：1、二维电泳所检测的发生表达变化的
10、蛋白都位于细胞浆内，而 iTRAQ 可检测到蛋白有胞浆蛋白外，还有线粒体蛋白、膜蛋白和核蛋白。2、二维电泳观察到的蛋白变化在 2 倍以上，而用 iTRAQ 计算出的蛋白变化在 1.3-1.6 倍之间。3、iTRAQ 技术在鉴定大分子和小分子蛋白方面也有优势。4、二维电泳是通过切断条带，再用质谱方法测量条带中的蛋白质，但该方法既不是非常敏感，也不是非常精确，获取的信息量很少。 而 iTRAQ 技术是基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果。5、iTRAQ 可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白质和碱性蛋白质，而二维电泳对这些蛋白
11、质都束手无策。由此得出结论：iTRAQ 技术比二维电泳技术能发现更多数量和种类的蛋白，但在比较胞浆蛋白及蛋白量的变化方面，二维电泳技术有一定长处，对 iTRAQ的实验结果有互补作用。2DGE（ 2-dimensional gel electrophoresis）是在蛋白质组学研究中应用非常广泛，但是它本身存在着难以克服的缺陷：操作费时费力，难以实现和质谱的直接连用，不易自动化；存在偏向性问题，对于相对分子量过大或过小（200000 或8000 ）的蛋白质、低丰度蛋白质（信号蛋白和转录因子等）、极碱性或疏水性蛋白质（膜结合蛋白或跨膜蛋白）难以进行分离解析。DIGE是在双向电泳技术的基础上，利用可
12、溶于荧光分光镜的，而且同质量和电荷相匹配的 CyDye 荧光素标记共价修饰蛋白，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品。虽然较 2DGE 能够显著提高结果的准确性、可靠性和重复性，但仍不能克服上述缺陷。iCAT 最早是由 Gygi 等提出的同位素亲和标记技术。 iCAT 试剂为唯一不同的是中间连接部分，连接部分连接同位素，其中连接 8 个氘原子的称为重链试剂，连接 8 个氢原子的称为轻链试剂。另外 iCAT 试剂还包括共价结合半胱氨酸残端的巯基反应基团及用于所标记的蛋白质或多肽亲和纯化的连接生物素。被 iCAT 试剂标记的生物样品，经酶解消化后，标记的肽段经生物素、亲和素色谱柱选择性
13、的聚集保留，并进行质谱鉴定。基于 iCAT 的原理，其存在内在的缺点：只有那些含有半胱氨酸残端的蛋白质才能被标记定量，那些在功能上有重要作用但不含半胱氨酸的蛋白质将会被遗失；另外 iCAT 依赖亲和素色谱柱可能导致由于低色谱容量和不可逆的结合造成的样品损失或者导致非特异性结合引起的样品污染。第二代可剪切 iCAT（cleavable Icat, ciCAT）技术利用13C 同位素代替氢元素并在连接生物素和亲和素间引入酸剪切位点，质谱分析前移去亲和标签，分析灵敏度提高了数倍，但仍不能解决上述缺点。SILAC 是 Ong 等 2002 年发明的再哺乳动物细胞培养过程中使用稳定同位素标记氨基酸的蛋白
14、组学技术。该方法将天然同位素（轻型）或稳定同位素（重型）标记的必须氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，稳定同位素标记的氨基酸可完全掺入到细胞新合成的蛋白质中，不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定。SILAC 相对于 iCAT有着更高的精确性，而且不需要复杂的化学过程和纯化步骤保证了样品相似的实验条件。然而 SILAC 不能用于临床的组织和血液标本。iTRAQ 技术作为一种新的蛋白质定量技术，相对于上述几种方法，具有无可比拟的优点：在同一实验中，可以对多达 4 种不同样本进行蛋白定量比较；可以对样本中的几乎所有蛋白质进行标记，因此可以对磷酸化蛋白、糖基化蛋白
15、等翻译后修饰蛋白进行定量、定性研究，从中可以获得更为详尽的样品信息；标记过程更简单，在室温条件下 1 h 即可完成，质谱检测更为灵敏。因此，iTRAQ 技术可以为多个不同时间段的样品分析、膜蛋白研究、疾病标志物的发现与鉴定提供定量信息，并可为感兴趣的目标蛋白进行绝对定量。目前能做itraq 技术的公司不多，上海舜田生物这块服务做的相对比较好的，结果质量可靠，而且周期能够保证。2.4 技术应用iTRAQ 技术应用非常广泛，它是通过 200 年开发的一种新的同位素标记试剂 iTRAQ，结合 LC/MS 技术已被广泛地应用于细菌、酵母、人体组织、细胞和体液等多种样本的蛋白质鉴定和定量。作为一种新的定量蛋白质组学研究方法，该技术可同时对 4 种样本进行定量分析并展现高通量、重复性好、敏感性高等特点。iTRAQ 技术还可以为我们研究前列腺癌的发生、进展机制，发现新的生物学标记物提供有力的技术平台。iTRAQ 技术还可以应用与比较野生型酵母菌株和两种同源突变型酵母菌株 xmlv、upflv 蛋白质表达差异。同时它可以对多种蛋白混合物或重组的蛋白混合物进行精确地定量。
