1、内部资料“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项传染病监测技术平台项目发热伴出血症候群监测方案（2012 版）专项实施管理办公室二一一年十二月目 录I. 流行病学设计 .1一、监测目的.1二、监测哨点医院的设置.1三、监测病例定义.1四、监测任务.1五、监测流程.2六、数据收集、分析和反馈.2. 标本的采集、运送及保存 .4一、标本的采集.4二、标本的运送.4三标本的保存.5III. 病毒检测内容及流程 .6一、血液标本检测流程图.6二、血液标本的病毒检测方法.6IV. 细菌检测内容及流程 .9一、标本检测流程图.9二、标本处理.10三、各种标本的实验室检测方法.11V. 寄生虫检测
2、内容及流程 .13一、标本检测.13二、实验室检测方法.13. 质量控制与信息管理 .14一、质量控制.14二、信息管理方案.17VII.附件 .19附件 1 发热伴出血症候群病例信息调查表 .19附件 2 发热伴出血症候群病例标本采样种类指导表 .20附件 3 发热伴出血症状症候群标本采集与处理、运送操作程序 .21附件 4 发热伴出血症候群核酸提取方法 .25附件 5 出血汉坦病毒、新疆出血热病毒、登革病毒实验室检测操作规程 .30附件 6 新布尼亚病毒实验室检测操作规程 .69附件 7 鼠疫菌实验室检测操作规程 .70附件 8 猪链球菌实验室检测操作规程 .79附件 9 钩端螺旋体实验室
3、检测操作规程 .82附件 10 立克次体实验室检测操作规程 .89附件 11 人嗜吞噬细胞无形体实验室检测操作规程 .101附件 12 查菲埃立克体实验室检测操作规程 .105附件 13 巴贝西亚虫实验室检测操作规程 .108附件 14 发热伴出血症候群实验室质量控制 .112附件 15 发热伴出血症候群细菌学实验检测结果汇总表 .114附件 16 发热伴出血症候群病毒学实验检测结果汇总表 .115附件 17 质量控制与信息管理工作用表 .1161I. 流行病学设计一、监测目的1、了解我国不同地区的发热伴出血症候群的病原谱构成。2、对症侯群病原学监测中所获得的病原体进行病原鉴定、分子分型分析。
4、二、监测哨点医院的设置1、每个承担发热伴出血症候群监测的实验室至少设置 5 家医院作为临床症候群病原谱监测的哨点医院。2、哨点医院必须在二级以上医院设置。3、原则上在监测实验室成员单位所在地级市设置，不要超过省辖区范围。各责任单位按照任务书中的任务量完成监测任务（任务量不得低于“十一五”期间的任务量） 。三、监测病例定义病例定义：急性起病，发热（体温37.5） ，病程小于 3 周，并有以下 2 个或以上的临床表现：1. 皮肤出血点或紫癜2. 粘膜出血点3. 鼻衄4. 咯血5. 呕血6. 血便7. 贫血8. 血小板低于正常水平且持续减少9. 其他出血表现根据以上表现，并除外其他有明确病因（如过敏
5、性紫癜、白血病、败血症等）引起的出血后，可建立发热伴出血症候群的诊断。四、监测任务采集标本种类：血液、脑脊液、尿液、淋巴液、分泌物。监测病原体种类：细菌：钩端螺旋体、猪链球菌、鼠疫菌、无形体、埃立克体、立克次体；病毒：汉坦病毒、登革病毒、新疆出血热病毒、新布尼亚病毒；2寄生虫：巴贝西亚虫。五、监测流程1哨点医院：根据发热伴出血症候群的监测病例定义，哨点医院监测科室的医生或护士在门急诊或病房发现符合监测病例定义的患者时，使用统一标准问卷，收集病例的基本人口统计学信息、临床症状、体征、血常规、临床生化检查、影像学检查、主要治疗和预后等信息（附件 1 发热伴出血症候群病例信息调查表） ，并进行相关标
6、本采集。哨点医院按月将本月所采集的全部标本信息填写标本采集登记表，并汇总至监测实验室。2监测实验室：按规定接收哨点医院的标本，并进行相关的细菌学、病毒学检测；按规定接收来自哨点医院的病例信息调查表、标本登记表，并定期进行结果的分析以及整合，使用表格参见附件 17“质量控制与信息管理工作用表” 。六、数据收集、分析和反馈（一）信息和数据的收集方式监测工作中规定的各类报表由监测实验室收集整理后以电子文件形式上报。（二）信息和数据的收集内容病例标本采集全血尿液分泌物淋巴液细菌培养、鉴定以及核酸检测病毒核酸检测， （阳性者 50%-100%继续进行病毒分离）急性期恢复期血清可疑病毒、细菌的抗体、抗原检
7、测猪链球菌病原分离、鉴定与核酸检测钩端螺旋体分离、核酸检测及抗原检测脑脊液鼠疫菌分离培养和鉴定；核酸检测3包括监测病例信息、标本收集信息和标本检测结果，要求完整填写附件 1“发热伴出血症候群病例信息调查表” 和附件 17“质量控制与信息管理工作用表”所列的全部表格。（三）数据和信息反馈 监测实验室每 6 个月将统计分析后的信息反馈给哨点医院。4. 标本的采集、运送及保存一、标本的采集（一）标本采集原则1. 尽量在发病早期和抗生素使用前采集相关标本。2. 填写病人信息个案登记表。3. 按照规范采集和分装处理标本。4. 标本采集后应尽快送至监测点实验室进行检测，如不能立即送检的，按照规范以适当方式
8、保存。送检标本应注明姓名、 （编号） 、标本来源、检验目的和标本采集具体时间。5. 注意生物安全防护，防止污染、传播和自身感染。（二）标本的采集类别，具体参见附件 2 发热伴出血症候群病例标本采样种类指导表1. 全血标本（抗凝及不抗凝） ，必采，尽量采集急性期、恢复期双份血清。疑似巴贝西亚虫感染的标本同时需要提供急性期的血涂片。2. 分泌物（皮肤、粘膜表面渗出物）3. 尿液标本（疑似钩端螺旋体感染者，尽量采集，具体标准见附件 10 发热伴出血症候群钩端螺旋体检测 SOP）4. 淋巴液（有淋巴结肿大症状者）5. 脑脊液（有神经症状者）各种标本的采集方法参见附件 3 发热伴出血症候群标本采集与运送
9、 SOP。二、标本的运送各种标本的运送方法参见附件 3 发热伴出血症候群标本采集与运送 SOP1. 血液标本的运送采血后应该尽快送检。在 24h 内送至实验室检测的无菌采血管，可在 4-8运输，若运输时间超过 24h，应在-20以下（尽量用干冰或液氮）运输。用于血清学检测的标本保存在 4-8。2. 分泌物、淋巴液、脑脊液的运送 所有的标本要尽快送至实验室进行检测。短途运输时，采用密封的转运箱 4-8运输。若运输时间在 24h 以上时，应在-20以下（尽量用干冰或液氮）运输。53. 尿液标本的运送标本收集后应及时送检，及时接种，室温下保存时间不得超过 2h（夏季保存时间应适当缩短或冷藏保存） ，
10、4冷藏保存时间不得超过 8h。所取标本按照卫生部人间传染的病原微生物名录的规定进行包装。运输按照卫生部可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定执行。三标本的保存所采标本抵达实验室后，标本按需要分装成所需份数，除检测用外，至少留一份置-80 冰箱长期保存备查。标本应尽快检测，24 小时内能检测的标本可置于4保存，4 小时内无法检测的标本则应置于-70或以下保存。标本应避免反复冻融。6III. 病毒检测内容及流程一、血液标本检测流程图按照课题要求，发热伴出血症候群的病毒检测必须完成所有血液标本的核酸检测，核酸检测阳性的标本按照 50%-100%的比例进行病毒分离。血清学检测各单位
11、视情况和标本种类、标本采集时间选择实施。双份血清必须进行 IgM 和 IgG 抗体的检测。二、血液标本的病毒检测方法（一）核酸检测根据本课题实施的总体要求，发热伴出血症候群的病毒核酸检测内容至少包括汉坦病毒、登革病毒、新疆出血热病毒、新布尼亚病毒。1核酸的提取：取 200-400l 血清或全血标本（标本使用量最多不超过 1mL）用于核酸的提取。核酸提取后适当分装，至少在-80冰箱内保存 1 份备份核酸，便于后续研究和抽样检测。核酸提取的方法包括：核酸检测血清（急性期和恢复期）血清学检测-80保存备份血标本50%-100%进行病毒分离与鉴定（符合生物安全条件的实验室）阳性结果 阴性结果未知病原检
12、测分析核酸提取 剩余核酸储存验证和深入分析备用7商品化的核酸提取试剂盒：德国 Qiagen 公司 QIAamp Viral RNA Mini 试剂盒传统的公认方法如 Trizol 核酸提取方法等。各单位根据硬件条件和储备的技术力量选择核酸提取的方法，根据选择的方法配备相应的试剂和设备。 （详见附件 4 发热伴出血症候群核酸提取操作规范）2核酸的检测：RNA 病毒的检测需要将提取的 RNA 逆转录为 cDNA，可用逆转录试剂盒或者一步法 RT-PCR 试剂盒。试剂及试剂盒的选择原则：可选包括 Invitrogen, Roche, Qiagen, Promega, Takara 等各大公司提供的
13、DNA 聚合酶，逆转录酶等 RT-PCR 试剂(盒)；具体核酸检测及验证程序参见附件 5“发热伴出血症候群病毒检测 SOP”。发热伴出血症候群的病毒核酸检测，各病毒检测基因和分型见下表：3质量控制：核酸提取和检测过程必须设立对照，采用上述(RT)-PCR 方法检测标本后，若无法判断扩增结果，则需要进行测序验证，确保检测结果的准确性。具体操作步骤参见附件 5“发热伴出血症候群病毒检测 SOP”。（二）病毒的分离培养1检测标准和方法从核酸检测阳性的样本中随机选择样本进行病毒分离，比例不少于总阳性例数的 50。针对发热伴出血症候群所获得病毒株，需进行鉴定（包括核酸检测、免疫学分析）和分子分型（参见附件 5 发热伴出血症候群病毒检测 SOP 和附件 6 新布尼亚病毒实验室检测 SOP） 。2病毒分离的质量控制整个分离培养过程要有严格的质量控制：细胞株：用于病毒分离培养的细胞株应有明确的生物学背景，排除支原体和其他病原体的污染，来源清楚。试剂、血清和抗体：分离培养病毒所用的试剂和血清以及鉴定病毒使用的抗体病毒名称 RT-PCR/PCR 筛查检测扩增基因 检测病毒型及亚型汉坦病毒 M 片段、S 片段 SEO 型,HTN 型,PUU 型登革病毒 M 片段、S 片段 DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4,新疆出血热病毒 M 片段、S 片段
