1、LC-MS-MS测定牛奶中三聚氰胺残留量的不确定度评定制 定 审核 批 准文件编号 WJKF-P-062版本编号 A制定时间LC-MS-MS 测定牛奶中三聚氰胺残留量的不确定度评定修改时间1. 概述本试验采用原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法(GB/T 22388-2008)测定牛奶中三聚氰胺残留量。通过对影响测定结果的不确定度分量的分析和量化，求出被测定的标准不确定度和扩展不确定度，给出各分量对测定结果不确定度的相对贡献，对测定结果进行了表述。2. 实验部分2.1. 仪器2.1.1. 检测仪器：液相色谱质谱联用仪岛津UFLC/ABI QTRAP3200色谱柱：Waters Atlantis H
2、ilic（50mm0.25mm0.25m）离子源：ESI源2.1.2. 天平：电子分析天平（AR1140）可精确到0.01mg,用于称量标准品。电子天平（SE202F），可精确到0.01g,用于称量样品。2.2. 测试过程称取1g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入8 mL 1三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以6000 r/min 离心10 min 。上清液备用。将上述上清液转移至阳离子交换固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液（ 5 mL 氨水：95 mL 甲醇）洗脱；流速不超过1
3、 mL/min。收集洗脱液，于50 下用氮气吹干，残留物用1 mL流动相定容，涡旋后过0.2 m微孔滤膜，供LC-MS/MS测定。称量三聚氰胺标准品配成甲醇溶液，稀释成适当浓度范围的标准品工作液；分别取 2L注入LC-MS-MS,以峰面积法制作标准曲线。根据5点标准曲线法，求得三聚氰胺的残留含量。测定程序见图1：本测试采用(1000.0 0.0051)g/mL的农药标准储备液配制成五种浓度的标准品工作液,每种溶液均用LC-MS-MS测定两次,得到相应的峰面积, 用最小二乘法拟合浓度- 峰面积曲线进行校准。3. 数学模型根据上述测定方法,可知与牛奶中三聚氰胺残留量有关的量值分别为,样品称样量,样
4、品初分散体积,提取液分取净化体积,最终样液体积及方法的回收率。分析各影响因素与牛奶中三聚氰胺残留量的乘除关系,可得其测量数学模型为: reprecfffmwhomVC文件编号 WJKF-P-062版本编号 A制定时间LC-MS-MS 测定牛奶中三聚氰胺残留量的不确定度评定 修改时间式中：W为试样中三聚氰胺的残留量,g/g; C为定容液中三聚氰胺的浓度,g/mL;V为定容体积，mL;frec为回收率校正因子,等于回收率的倒数。fhom为均匀性因子;frep为重复性因子;m为样品质量, g.4. 不确定度分量的主要来源4.1 校准过程引入的不确定度包括由5点标准品工作液的浓度- 峰面积拟合的直线求
5、得定容液浓度C时所引入的不确定度和标准储备液稀释成标准品工作液所引入的不确定度 。4.2 样品质量引入的不确定度由天平的最大允许误差（MPE）构成。4.3 体积引入的不确定度由体积量取器具的校准不确定度和其校准温度和使用温度不同导致的不确定度组成。4.4 制样过程引入的不确定度测试样品的制备过程非常复杂,需经过提取、净化、浓缩等步骤,每一步操作都会引入不确定度,要逐步确定每一步骤对测量结果不确定度的贡献是相当困难的,可采用检测方法确认中的有关数据(如回收率) ,对制样过程引入的不确定度进行评定。4.5 测试过程随机效应导致的不确定度包括样品的均匀性和代表性,天平的重复性,体积刻度充满的重复性,
6、制样过程中净化、浓缩等各步骤的重复性,进样的重复性等因素引入的不确定度。不确定度分量来源见图2。文件编号 WJKF-P-062版本编号 A制定时间LC-MS-MS 测定牛奶中三聚氰胺残留量的不确定度评定 修改时间5. 不确定度分量的评定5.1 校准过程引入的不确定度5.1.1 标准物质引入的不确定度（1） 标准储备液的不确定度本方法中使用的是三聚氰胺标准品。标准储备液的配制是称取10mg标准品溶解于10 mL容量瓶中，浓度为1000g/mL. 标准品纯度的不确定度。购自xStandard的三聚氰胺纯度为99.5%，可以认为其允许误差为0.5%，按照均匀分布处理，其标准不确定度和相对标准不确定度
7、分别为：3%.05.)(Pu1rel 标准品称量的不确定度。用精确至0.1mg的电子天平称取10.0mg三聚氰胺标准品，不确定度主要由天平校准、环境、称量的变动性（随机性）所产生。通常情况下忽略环境因素的影响，而称量变动性（随机性）所带来的不确定度以在方法重复性中予以评定，故在此不予重复评定。评定过程中所引入的独立不确定度分量来自于天平的校准。所用天平的最大允许误差为0.05 mg，两次称量（减重法）引入的标准不确定度属B类不确定度，按均匀分布处理为： 20.5().41()3rummg其相对标准不确定度为：.41.rel 标准储备液的不确定度： 2222()=0.3+.41=0.5rel r
8、elrelruCsPu（2） 标准品工作液配制过程所引入的不确定度 此不确定度由标准储备液浓度的不确定度、配制标准中间液和标准品工作液引入的体积不确定度组成。1.0g/mL标准中间液的配制：将0.1mL标准储备液(1000.0 0.0051g/mL)完全转移至100.0 mL容量瓶（A级）中,用甲醇定容后配成1.0g/mL标准中间液。容量瓶体积引入的不确定度：根据 JJG196-2006 常用玻璃量器检定规程：A 级 单标线100.0 mL 容量瓶允许差为0.1mL。按矩形分布处理，标准不确定度和相对不确定度分别为：mL0.583.1Vu.rel0.1g/mL标准液的配制：使用1mL移液管吸取
9、1mL 1.0g/mL标准中间溶液，移至10mL 容量瓶（A级）中,用甲醇定容。配制过程引入的不确定度：根据 JJG196-2006 常用玻璃量器检定规程：A 级单标线10mL 容量瓶允许差为0.02mL，单标线 1mL 移液管的容量允许误差为0.008 mL。按矩形：文件编号 WJKF-P-062版本编号 A制定时间LC-MS-MS 测定牛奶中三聚氰胺残留量的不确定度评定修改时间分布处理，标准不确定度和相对不确定度分别为 mL0.123.2Vu.rel4680.1.03Vurel1.0g/mL 标准液的配制过程的相对不确定度为：048.26.1.322 Vusrelrelrel按上述步骤计算
10、，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20g/mL 标准品工作液的配制过程的不确定度见下表，A 级单标线 10mL 容量瓶允许差为0.02mL；移取0.1mL，0.2mL，0.5mL 体积时使用 1mL 分度移液管，容量允许差参见 GB 128071991。表1 不同浓度标准品工作液配制过程引入不确定度的结果计算时取最大不确定度值,即0.05g/mL标准溶液的相对标准不确定度值0.0060。 温度效应：操作一般是在205下进行的，10mL容量瓶因温度引起的体积变化为：式中，3.310 -6 -1玻璃的热膨L)0.165(m-13.10mLVte胀系数。按矩形分布处理，标准不确定度和相对
11、标准不确定度分别为： )(9.65.)(utem00.51terelt tmV（3） 标准物质引入的相对不确定度： 2222()()()()()0.51+.08.6+0.95=.07relfrelrelrelreltmuCsuVsu文件编号 WJKF-P-062版本编号 A制定时间 2009.4LC-MS-MS 测定牛奶中三聚氰胺残留量的不确定度评定 修改时间5.1.2 采用最小二乘法拟合标准曲线求得试样浓度C过程中所引入的不确定度测试过程采用了 (1000.0 0.0051)g/mL 的标准储备液配制了0.01，0.02，0.05，0.10，0.20g/mL标准品工作液，分别上机测定3次，得
12、到相应的面积A,采用最小二乘法拟合，得到线性回归方程A=（为截距，为斜率）和方程的线性相关系数，对试样进行3次测定，由试样峰面积在标准曲线的线性回归方程求得的平均浓度=0.027g/mL，则由最小二乘法拟合标准工作曲线所引入的标准不确定度为0.0014（g/mL）21CsSAucbpnScS（A）标准溶液的峰面积残差的标准差，6.23E+0521njjacn标准溶液的平均浓度， 0.078（g/mL）Cs 1jCs标准溶液浓度残差的平方和， 65.2Sc 21njScsn标准溶液的测定次数，本试验为15次；p试样的测定次数，本试验为3。最小二乘法拟合标准工作曲线所引入的相对标准不确定度为0.0
13、52relucC5.1.3校准过程引入的不确定度2222()0.79.50.6rel rel relafuc文件编号 WJKF-P-062LC-MS-MS 测定牛奶中三聚氰胺残留量的不确定度评定 版本编号 A制定时间 修改时间5.2 样品质量引入的不确定度方法要求样品称量准确至0.01g，天平的说明书给出的最大允许误差（MPE）为0.05g，按矩形分布处理，标准不确定度和相对不确定度分别为（g）0.5=.6423u(m)01.rel5.3 由定容体积引入的不确定度以甲醇溶解旋转蒸发残留物，准确至1mL，1mL移液枪的允许误差为0.01 mL， 0.58mL3uV由定容体积引入的相对标准不确定度
14、为：.0.1rel5.4 制样过程引入的不确定度制样过程产生的不确定度采用0.1g/mL (与所测样品浓度水平相近) 5次样品添加回收率的相关数据计算。5次添加回收率测定结果为: 96.0%、95.2%、97.1%，93.4% ,96.7%，平均添加回收率为 = 95.7%,标准偏差为 = 1.46%,标准不确定度采用平均值RRS的标准偏差,则标准不确定度和相对标准不确定度分别为: 1.85%0.6RnSu)(.89.7relRu同时,必须对平均回收率进行显著性检验,以确定添加回收率校正因子frec是否在计算公式中采用。显著性检验采用t检验,当检验值t大于或等于临界值t(95,4) = 4.3
15、0时,则与100%有显著性差异, frec必须在计算公式中采用以修正结果;当检验值t小于临界值t(95,4)时,则说明 与100%无显著性差异,不必采用frec修正结果。计算结果如下:10%10|95.7%|t 6.20Rut值大于临界值t(95,4)= 4.30,说明Rec与100%有显著性差异,必须在计算公式中采用frec修正结果。5.5测试过程随机效应导致的不确定度按照原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法(GB/T 22388-2008)测定牛奶中三聚氰胺残留量,将样液浓度输入测量数学模型,可知牛奶中三聚氰胺残留量分别为: 0.022g/g、0.029g/g、0.026g/g,平均值W =0
16、.0257g/g, 标准偏差：，则随机效应导致的标准不确定度和相对标准不确定度分别为:0.35Sw文件编号 WJKF-P-062LC-MS-MS 测定牛奶中三聚氰胺残留量的不确定度评定 版本编号 A制定时间 修改时间0.45130.2Swun278.rel6. 合成不确定度和扩展不确定度不确定度分量详见表试样中三聚氰胺残留量测定结果的相对合成不确定度为： 22222,()()()()()()0.56.40.58.60.789relrel relrelrelrelcuwcaumVuRw（g/g）,()=().27.94.23relccu7. 扩展不确定度在没有特殊要求的情况下，按国际惯例，去扩展因子k=2，则扩展不确定度：（g/g）()0.3.086cUkw8. 测定结果的报告按照原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法(GB/T 22388-2008)测得牛奶中农药三聚氰胺残留量结果为：。本例结果为（0.0257 0.00486）g/g,k=2。
