1、3.2.3 双链 cDNA 的合成及精制(1).第一链 cDNA 的合成采用 TaKaRa 公司一链合成试剂盒进行，具体操作如下：在 PCR 管中加入下列反应成分：总 RNA 约 5g，Oligo(dT)18（50mol/L）1L，dNTP（10 mmol/L）1L，DEPC-H2O 补足 10L。于 65变性 5 min，置于冰上 2min。向上述 PCR 管中继续加入下列成分：5RT Buffer 4L，RNase Inhibitor（40 U/L ）0.5L，M-MLV Reverse Transcriptase（5 U/L）1L ，dd H2O 4.5L，总体积 20L，混匀稍离心，4
2、2温浴 1 h，7015 min 使酶失活，直接进行第二链合成。42恒温 1 h，70水浴 10 min，然后置于 4冷却。然后进入第二链的合成(2).第二链 cDNA 的合成使用 DNA polymerase（TaKaRa，大连）和 RNase H（TaKaRa，大连）进行，体系如下:Component volumecDNA 第一链 10.0L反应 buffer 14.0LdNTP(10mM) 1.5LDNA Polymerse（4U/ L） 3.5LRNase H（10U/ L） 0.2LDNA 连接酶(350u/L) 0.3Ldd-H2O 10.5LFinal volume 40.0L轻
3、轻混合，稍离心，PCR 仪上 16反应 2.5 h，70终止反应 10 min。加入 0.4LT4DNA 聚合酶，轻轻混合， PCR 仪上 37反应 10min。加入 5L 200 mmol/L EDTA 终止反应。(3).双链 cDNA 的精制向第二链合成产物中加入 50L 的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液，剧烈混匀，室温 12000 r/min，离心 10 min。将上清转入另一离心管中，加入 100L 预冷（-20）的异丙醇，-20放置 2 h 以上。4，12000 r/min，离心 15 min，弃上清，沉淀用沉淀用 75的乙醇（4放置）洗两次。沉淀风干 5-10 min，加
4、入 1020L 的 ddH2O 溶解。用 1.5的琼脂糖快速电泳检测，并测定 OD 值。-20保存备用。413.2.4 cDNA-AFLP 差异显示3.2.4.1 限制性酶切酶切体系参照内切酶说明书进行。(1).Taq酶切：在 PCR 管中加入模板 cDNA 约 200 ng，10RL Buffer 4L ，Taq酶（20u/ L ）0.5L，ddH2O 补足 40L，混匀，稍离心，65反应 2 h。(2).Ase酶切：在上述管中继续加入以下成分：10RL Buffer 2 L，Ase 酶（20u/ L ）0.5L，ddH2O 7.5L，总体积 50L，混匀，稍离心，37反应 2 h。3.2.
5、4.2 接头连接向酶切产物中继续加入下列成分：Taq接头（25pM ）2L ，Ase接头（5pM）1L，ATP(10mM)0.5L，T4 DNA Ligase Buffer 0.5L，T4 DNA Ligase(350u/L)0.2L ，ddH2O 0.8L，总体积 55L，混匀，稍离心，37，3h。连接反应结束后于-20保存。注：Taq接头分别由 T1 和 T2 等莫尔浓度配制， Ase接头分别由 A1 和 A2 等莫尔浓度配制.3.2.4.3 预扩增预扩增体系为：Component volumecDNA 酶切连接产物 5.0L10PCR buffer 2.0LMg2+(25mM)2.0Ld
6、NTP(10mM)0.5L预扩引物 A3（20M）1.0L预扩引物 T3（20M）1.0LTaq DNA Polymerase(5U/L)0.15LddH2O 8.35LFinal volume 20L混匀，稍离心，进行 PCR 扩增反应。扩增程序为 942min；9430s ，5630s，7260s，共 25 个循环；7210min。结果取 5L，用 1.0的琼脂糖检测。3.2.4.4 选择性扩增预扩增产物稀释 20后进行选择性扩增，其体系为：42Component volume20稀释的预扩增产物 2.0L10PCR buffer 2.0LMg2+(25mM)2.0LdNTP(10mM)0
7、.5L选扩引物 A（20M）1.0L选扩引物 T（20M）1.0LTaq DNA Polymerase(5U/L)0.2LddH2O 11.3LFinal volume 20.0L混匀，稍离心，进行 PCR 扩增反应，扩增程序为 942min；9430s ，65（每循环降低 0.7）30s，7260s，共 12 个循环；9430s，5630s ，721min 共23 个循环；7210min。 。共用 16 个 A 引物和 16 个 T 引物，组成 256 对引物组合对所有材料分别进行cDNA-AFLP 差异显示分析。3.2.4.5 聚丙烯凝胶电泳分析电泳分析采用 20 cm20 cm 的竖直板
8、电泳槽进行。非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度 6.0%，电泳液为 1TBE。电泳参数：恒压 280 V。上样量 4.0L，分子量 marker 稀释 3后上样 2.0L 。电泳完毕，剥胶，进行银染分析，具体操作如下：(1).将凝胶于 300 mL 固定液（2乙酸，0.1% 冰乙酸）中固定 10min；(2).在 0.2%的硝酸银渗透液中渗透 30s；(3).蒸馏水漂洗 30s；(4).0.002%的硫代硫酸钠水溶液中漂洗 30s；(5).在显色液（ 1.5%NaOH，0.4甲醛）中显色至条带清晰；(6).自来水冲洗照相，以做分析。3.2.4.6 差异片段的聚丙烯酰胺凝胶回收与再扩增在差异条带的对应位置
9、用干净的刀片切取条带置离心管中，加 100L ddH2O 于 55下温浴 30min，-204h 或过夜。沸水浴 15min，然后稍离心，上清转入新离心管，加入等体积的异丙醇（-20预冷）沉淀 DNA。4 ，12000 r/min 离心 15min，用 75%乙醇洗沉淀，将沉淀风干 5-10 min，最后溶于 20L ddH2O。取 5L 回收产物做模板，用原选扩引物及体系再次进行扩增。为增加回收产物的量，可将原反应体系依比例扩大。扩增程序为 942min；9430s，5630s ，7260s，共 35 个循环；7210min。再扩增产物进行 1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，并用胶回收试剂盒（天
10、根公司）进行片段回收，具体方法如下：(1).切取含目的 DNA 片段的凝胶薄片，并向离心管中加入 600L 溶胶液 PN，50oC温育约 10min 直至凝胶完全熔化，期间间断振荡混合几次；(2).柱子平衡：向吸附柱 CA2 中（吸附柱放入收集管中）加入 500L 平衡液 BL，12000 rpm 离心 1 min，到掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(3).将胶溶解液温度降至室温后，加入上述平衡过的吸附柱中，室温放置 2 min，12000rpm 离心 45s，到掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；(4).向吸附柱 CA2 中加入 700L 漂洗液 PW，12000 rpm 离心 45s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(5).向吸附柱 CA2 中加 500L 漂洗液 PW，12000 rpm 离心 45s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；(6).12000 rpm 离心 2 min，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(7).将柱子放入一个干净的 1.5 mL 离心管中，用 30L ddH2O 洗脱 DNA，12000 rpm离心 2min 收集 DNA 溶液。
