1、2.1.4 同名异物小白菜的 AFLP 鉴定方法模板 DNA 的制备：（CTAB 法）(1)取 2ml 离心管盖大小的三片嫩叶放入 2ml 灭菌的离心管，用相应大小的尖头玻璃棒研磨，使细胞壁充分破碎。(2) 2% CTAB 提取液在水浴锅中预热至 65。加热前在 2% CTAB 提取液中加入 0.4%的巯基乙醇。(3) 加入 750l 2%的 CTAB 提取液于 2ml 的离心管中， ，充分混匀后 65水浴 1 小时，期间每隔 10 分钟轻轻摇动一次。注意：样品的量不能太多，否则 CTAB 加入的量太少，细胞裂解不充分。(4) 冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）轻轻转动摇匀。(
2、5) 保持温度在 18以上，13000rpm 离心 10 分钟。注意：温度太低则DNA 容易和 CTAB 结合而沉淀。(6) 用大口径枪头缓慢吸取上清液，重复步骤（4） ， （5）使溶液中的蛋白和多糖沉淀充分。(7) 用大口径枪头缓慢吸取上清液，加入预先加好 600l 异丙醇的 2ml 离心管。注意：吸取 2/3 的上清即可，不能吸取太多，防止将氯仿：异戊醇或沉淀吸入，降低 DNA 的纯度。(8) 静置。(9) 13000 rpm 离心 10 分钟，弃上清。加入 1ml 预冷的 70%的乙醇漂洗 2次，用无水乙醇漂洗 1 次。置于超净工作台上吹干 1-2 小时，或用冷冻真空干燥机抽干。(10)
3、 加入 100l 0.1TE 或者水溶解 DNA，每 100l 加入 0.5l 的RNase（2mg/ml） ，室温放置 0.5 小时。(11) 取 2l DNA，以 DNA 为对照进行琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的浓度，稀释为 100ng/l 左右，-20保存。 （试剂的配置见附录）AFLP 分析的操作步骤(1) 基因组 DNA 的酶切和连接基 因 组 DNA 的 双 酶 切 和 接 头 的 连 接 采 用 一 步 完 成 ， 其 反 应 体 系 为 25.0l，包 括 ：MseI(10U/l) 0.5lEcoRI(12U/l) 0.5lMseI 接头 (50pmol/l) 1.0lEcoR
4、I 接头(5pmol/l) 1.0l 10ATP 1.0l10NEB(buffer) 5.0l BSA(10mg/ml) 0.25lT4 连接酶(3U/l) 0.5l基因组 DNA(100ng/l) 3.0lddH2O 12.25ul总体积 25.0l离心混匀，37酶切连接反应 812 小时，酶切连接处理完成后，65水浴处理 10 分钟，使酶失活，冰浴待用。接头的序列和配置见附录(7)。(2) DNA 片段的预扩增将酶切连接产物稀释 20 倍，按如下体系预扩增：MseI 接头 (M+0，100ng/l) 0.3lEcoRI 接头(E+0，100ng/l) 0.3l10PCR Buffer 2.
5、0lMgCl2(25mmol/L) 1.5ldNTP(10mmol/L) 0.4lTaq polymerase(5U/l) 0.2l DNA 模板 4.0lddH2O 11.3l总体积 20l混合后，离心数秒，按如下 PCR 程序扩增:94 5min94 30sec56 30sec 20 cycles，72 1min72 7 min60 30min4保存。预扩完成后，取 5l 预扩增 DNA 产物和 5l 上样缓冲液 (loading buffer)混合后在 1.0%琼脂糖凝胶，5V/cm， 1TBE 条件下检测预扩增的效果。5l 预扩增产物加入 95l0.1TE，混合-20保存备用。其余预扩
6、增 DNA 产物，-20 保存备用。(3) DNA 片段的选择性扩增扩增体系如下：10PCR 缓冲液 2.0lMgCI2（25mmol/L） 0.8ldNTP(10mM) 0.45lTaq 酶(5U/l) 0.15lEcoRI 引物(50ng/l) 1.2lMseI 引物 (50ng/l 1.2l模板 DNA 6l加超纯水 至 20l扩增程序为:94 2min94 30sec65 30sec 13cycles，-0.7/cycle72 1min94 30sec56 30sec 30cycles72 1min72 7min变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将选择性扩增的产物 20l 中加入变性上样缓冲液 8
7、l（98%的甲酰胺，10mM 的 EDTA，0.25% 的溴酚蓝，0.25%的二甲苯青） ，95变性 5 分钟，然后在冰浴中迅速冷却。在 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶（配方见附录）上电泳 1.5 小时，电泳仪采用 Bio-rab 垂直电泳仪。加样量为 8.5l。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作规程：(1) 玻璃板的清洗玻璃板是否清洗干净直接关系到聚丙烯酰胺凝胶灌制的质量，干净的玻璃板可以明显防止灌胶时产生气泡。最好提前用洗洁精将玻璃板浸泡一天。洗干净的玻璃板晾干备用。(2) 涂板清洗干净的短板用 2%剥离硅胶（配方见附录）均匀的涂在短板上，将 0.5%的粘合硅胶（配方见附录）均匀的涂在长板上，千万不能
8、涂错。风干 30 分钟。(3) 灌胶将长板和短板装配好，调至水平，检查梳子是否合适，取 60ml（根据不同型号的电泳槽确定胶的用量）6%的聚丙烯酰胺胶加 250l 过硫酸铵和 50l TEMED 轻轻混匀，把板的一边抬起将胶缓缓的灌入。当胶到底部后迅速将板调至水平。将梳子插入适当的位置，聚合 2 小时以上用于电泳。(4) 预电泳将梳子小心拔出，用洗瓶将插梳子的一端清洗干净，然后擦干净玻璃板，将电泳槽装配好后，在电泳槽中加入 1TBE，反向插入梳子至刚与胶面接触，在 75W 恒功率预电泳 30 分钟。 （不同型号的电泳仪采用不同的恒定功率）(5) 变性将选扩的样品在 95变性 5 分钟，然后在冰
9、浴中迅速冷却，使 DNA 保持单链状态。(6) 电泳将点样孔中的气泡吹打干净，每孔点样量为 8-9l。75W 恒功率电泳 1.5 小时。不同型号的电泳槽所使用的最佳恒定功率不同，以电泳时温度保持在 50为宜，电泳的时间以各条带能均匀区分开为宜。银染程序:（试剂配置见附录）(1) 固定 电泳结束后，撬下短板。浸入固定液（10%冰醋酸）轻轻震荡30 分钟，至指示染料消失。(2) 漂洗 蒸馏水轻轻震荡洗涤 2 次，每次 5 分钟。(3) 染色 将胶板放入染色液（硝酸银 1g/L，37%甲醛 1.5ml/L）轻轻震荡30 分钟。 （现用现配）(4) 漂洗 蒸馏水中漂洗一下，迅速取出控水。应在 5 秒中内放入显色液。(5) 显色 将胶板放入-20预冷的显色液（现用现配）中，并加入硫代硫酸钠（10mg/ml）400l，充分震荡直至条带清晰，背景开始变深为止。温度较高时可加入少量的液氮。(6) 终止 将胶板取出迅速放入 10%冰醋酸终止溶液， （第一步操作时用过的） 。轻摇 5 分钟左右。(7) 漂洗 在蒸馏水中轻轻漂洗 10 分钟以上。(8) 干燥 将胶面放于通风橱中充分干燥。(9) 照相或扫描 将干燥后的胶板进行照相或用扫描仪进行扫描成像。
