1、分子遗传标记及其应用摘要：分子遗传标记育种是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用。本文介绍了分子遗传标记的概念及应用。关键字：分子遗传标记，标记辅组选择Abstract：Served as an newly rising genetic marker technique,molecule genetic markers is being widely used on molecule biology,especially in molecule genetic researches. This article gives a brief introd
2、uction of the conception and utilization of molecule genetic markers.Keywords:marker assisted selection；molecule genetic markers一 分子遗传标记技术11 分子遗传标记的定义DNA分子遗传标记技术是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用，由于真核生物的遗传信息都储存在染色体和细胞器基因组的DNA 序列中，因此从理论上讲，DNA水平上的分子标记是所有遗传标记中最为稳定，最为可靠的。随着现代分子生物学技术的发展，使直接利用DNA序列
3、中核甘酸的变异作为遗传标记成为了可能。目前，对分子遗传标记较完整的描述，是指易于识别，遵循孟德尔遗传模式的，具有个体特异性或其分布规律具有种质特征的某一类表型特征或遗传物质；其范围包括： 基因或遗传物质的产物的变异特征； 作为基因或遗传物质载体的染色体的形态学变异； 基因或遗传物质本身的变异 1。12 分子遗传标记的作用分子遗传标记能够在DNA水平上对编码和非编码序列的遗传变异进行检测，不受内外环境的影响；大多数分子标记多态性的信息含量很高；而且检测迅速、方便，无组织差异。由此可见，分子遗传标记是最理想的遗传标记，这决定了它能够得到迅速的发展，并能够广泛的应用于遗传育种研究和农牧生产的各个领域
4、。遗传标记主要有如下应用（1）定位基因序列在染色体上的位置。（2）构建遗传连锁图谱。（3）定位数量性状基因座。（4）对与性状相关的候选基因和主基因进行鉴定。（5）对动物种群遗传资源进行评估。（6）进行系谱/血缘分析。（7）分类学与分子系统学研究，进行系统发育分析和绘制生物进化树，研究基因结构和功能进化。（8）胚胎的早期性别和性状诊断，为选择性坠胎术提供参照依据。（9）动物基因身份证。（10）遗传性疾病或遗传缺陷的诊断与分析。（11）已知病原微生物的株型（毒力）、抗性分型。（12）对混合感染和继发感染疾病进行诊断与分析。（13）在分子遗传流行病学中的病源鉴定，毒力进化跟踪，传播途径、速度、媒介分
5、析和流行规律分析。（14）微生物群落的生态位检测。（15）出入境病原、种质监测。（16）转基因动植物上的应用。（17）进行药物基因学（Pharmacogenomics）研究。（18）分子育种（molecular breeding ）应用（19）器官移植中的应用。13 分子遗传标记的发展趋势当前分子遗传标记的发展，有以下五个趋势：（1）对现有遗传标记技术进行优化与集成，降低检测成本，提高检测效率，组合已有标记技术，同时提高标记的靶向性，使反映的信息专一性更加突出。（2）充分利用基因组结构的共性特征开发新标记，如重复序列、散在保守序列，新基因家族，启动子保守序列等，利用基因和基因内部模块“界标”保
6、守序列，挖掘并利用基因组中编码元件与非编码序列的保守特征，从而发现更多更稳定、效应更显著的分子标记。（3）开发揭示新遗传变异类型的标记，如表观遗传差异，表达丰度差异，表达模式差异等。（4）标记开发向高通量方向发展，如SNP芯片，变性高效液相色谱DHPLC，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF)等。（5）同时揭示多层次信息的复合标记，从基因组转录组蛋白组代谢组表型组，各层次信息的不平衡性决定了仅用单层次标记的局限性，使用多
7、层次的标记，更能展示基因的表达调控方法和作用。14 分子遗传标记的主要方法随着分子生物学技术的发展，在DNA分子遗传标记中，出现了越来越多的新方法，现选择主要方法，介绍如下：141 DNA 限制性片段多态(RFLP)技术RFLP技术是1980年美国学者 Botstein首次发现的第1代分子标记技术 2，当核苷酸序列出现碱基替换、插入、缺失及倒位等分子重排时，可能会导致限制性酶切位点的丢失和获得 3，RFLP 的优点主要表现在：RFLP标记无表型效应，非常稳定，故其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；RFLP标记在等位基因间是共显性的，因此能区别纯合子和杂合子，非等位基因间则不存在上位效应，
8、互不干扰；RFLP是起源于基因组DNA的自然变异，这些变异在数量上几乎不受限制，可以选取足够数量的代表整个基因组的RFLP 标记。因此，作为第一代分子标记，至今仍是使用最为广泛分子遗传标记技术。142 DNA 扩增片段单链构象多态(PCR - SSCP) 1989年，日本Orita M 等 4发现单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象。这种立体结构主要由其内部碱基配对等分子内相互作用来维持。故当有碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使其分子构象发生改变。因空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中前进时受到的阻力不同，会导致电泳的速度不同，经染色后就可以在凝胶上面检测出结果，因此该方
9、法被称为单链构象多态性( single strand comformation polymorphism，SSCP) 分析。PCR-SSCP技术是把 PCR技术和SSCP技术相结合，将PCR 扩增产物变性后， 置于碱性非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，从而检测相应的遗传变异。PCR-SSCP 分析法的优点在于：操作简单，不需特别贵重的仪器，PCR 产物变性后无需特殊处理即可直接电泳；实验步骤少，周期短；所用试剂常见，成本较低；适合于进行大样本筛查，在做 DNA 测序之前采用此法，可以大大避免盲目测序所带来的麻烦，加快测序速度，PCR-SSCP 既能分析 DNA 的多态性，结合软件分析后，还可以检测
10、DNA 序列中的各种突变，还可以应用到基因制图等领域。143 随机扩增多态性DNA随机扩增多态性DNA（RAPD）技术最早是1990年，由美国杜邦公司农产品研究中心的Williams等 5用任意顺序排列的10个碱基的寡核苷酸片断作引物，以未知序列的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增来获得一组随机的不连续的DNA 片段。并将此法命名为RAPD。目前RAPD 技术已被广泛应用于遗传学的各个方面。包括进行品种鉴定和系谱分析，基因定位，易位系的鉴定和构建遗传图谱等。144 微卫星 DNA 分析微卫星DNA又称简单重复序列( simple sequence repeat，SSR) ，广泛分布于生物体整
11、个基因组中，具有数量多、多态性丰富、保守性强、共显性遗传、进化承受选择压力小，操作简单、重复性好和检测结果准确等优点 6。微卫星DNA分析法是近十多年来发展起来的一种新兴分子遗传标记。微卫星分子标记是共显性标记， 较其他分子标记方法相比，有更高的个体特异性和可重复性，在生物群体进化研究、核基因组研究、遗传连锁图谱的构建、亲缘关系鉴定、基因定位、品种鉴定等领域已得到广泛的应用。145 DNA 分子杂交技术分子杂交（molecular hybridization）的基本原理是待测的单链核酸序列与已知序列的单链核酸（探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA， RNA与R
12、NA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA 或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。作为探针的已知DNA或RNA片段一般为3050核苷酸长，探针必须预先标记以便检出杂交分子。标记通常为同位素标记法和生物素标记法。分子杂交方法可分为液相杂交和固相杂交法。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固相杂交法最为常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，是一种研究最早且操作复合的杂交类型，应用不如固
13、相杂交那样普遍。主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。146 裂解酶片段长度多态性(CFLP)技术裂解酶片段长度多态性(cleavase fragment length polymorphism，CFLP) 分析，是近年来分子生物学领域出现的一种用于研究基因突变和分型的技术，具有快速、灵敏、准确、操作简便等优点 7。CFLP基本原理是：先将DNA加热变性，再冷却到一定温度，使被分开的单链DNA 按碱基配
14、对规律自身形成特定的发夹圈。经裂解酶切断其底部5端核苷酸链，经电泳后，有标记的一段会显影，即为CFLP 图谱。它通过裂解酶E对事先标记的待测DNA作特异性酶切，产生一组特异性的DNA片段，显影后就形成了一级结构依赖性的结构指纹图谱从而检测DNA 序列的变化。二 分子遗传标记在育种中的应用人类有意识或无意识地对畜禽的表型进行选择以提高其生产性能已有几千年的历史，而最近几十年才开始进行真正科学、系统的育种。至今，在家畜育种中人们仍然普遍采用动物模型BLUP 法进行个体遗传评定，这种方法对于一些遗传力低的性状、限性性状以及一些难以测量的性状，取得的进展却非常有限。同时由于经历了长期的选择，在畜禽性状
15、上的遗传改良速度也开始呈现变慢的趋势，迫使育种学家寻求一种新的突破性的育种方法。DNA分子标记能够在分子水平上对基因序列的遗传变异进行检测，不受内外环境的影响，检测迅速、简便，无组织特异性 8，因此能够广泛应用于遗传育种研究的各个领域。人们将占据染色体特定区域的微效多基因群称为一个数量性状基因座(Quantitative trait locus， QTL) 。通过分析影响家畜性状的QTL与分子标记的连锁关系，确定其在染色体上的位置、单个效应及互作效应，并通过选择可识别的分子标记从而选择具有育种意义的QTL9。分子标记在标记辅助选择中的应用依赖于家畜高精度遗传图谱的构建，与QTL紧密连锁的分子标
16、记的筛选和QTL的精确定位与标记的连锁分析 10。分子标记能否在育种实践中发挥应有的作用取决于与目标基因紧密连锁的分子标记，多态性高的分子标记绘制的遗传图谱，分子标记自动化分析成本的降低、实验的简化和改进应用标记预测育种值的方法这四个因素 11。随着生殖生物学和胚胎操作技术的发展，有很多新的技术被用于家畜育种上。超数排卵和胚胎移植(multiple ovulation and embryo transfer，MOET) 在育种中的使用，使后裔测定时在对同胞家系应用个体标记信息进行选择，成为了可能。使用MOET方法培养出的核心群具有更集中的群体结构，可更经济，更有效地对所有候选者进行基因型检测，
17、增加了MAS的可行性 12。目前，DNA多态性标记在猪育种方面引起了研究者的极大兴趣， 在某些方面已为猪育种实践所应用。截止2005年，猪基因组数据库中的基因位点数为3776 个，共发现了4448个遗传标记，其中微卫星标记1653个，ISH标记562个，RFLP标记258个，SSCP 标记73个，小卫星标记19个 13。在家禽业方面的分子遗传标记，其研究进展远远落后于家畜类(猪、牛和绵羊等) 14，近年来在有关家禽数量性状与分子标记遗传相关研究方面，应用的分子标记主要是DNA指纹，其次是RFLP 15。分子遗传标记技术在鱼类遗传结构分析、构建遗传图谱、亲缘关系鉴定等方面的研究中也得到了较为广泛
18、的应用 16。分子遗传标记在鱼类上的作用主要体现在评估鱼类遗传多样性，鉴定物种；监测鱼类遗传多样性；进行中长期鱼类多样性保护；和加强渔业资源管理这四个方面。三 分子遗传标记在分类学上的应用采用常规的形态学或细胞学性状对一些物种进行分类在很多时候缺乏遗传基础，因为这些表型特征是不稳定的，很容易受到环境因素的影响 17，而分子遗传标记稳定性强，解决了很多分类学方面的难题。DNA分子是由G，A，C，T4种碱基构成，为双螺旋结构的长链状分子，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，不同的物种其遗传性不同，这种遗传上的差异便表现在这4 种碱基排列顺序的变化之中，这就是生物的遗传多样性(gene
19、tic diversity) 。比较物种间DNA 分子的遗传多样性的差异来鉴别物种就是DNA 分子遗传标记鉴别(identification by DNA molecular genetic marker) 。在真核生物中 ，其单倍体细胞的碱基对数(bp) 在10 710 11之间，在DNA 分子上，有编码与物种存活密切相关的基因区域、编码与物种存活不十分密切相关的基因区域和非编码基因区域。基因组DNA的这些不同区域在生物进化过程中所受到的选择压力不同，正是由于这种DNA 分子不同区域承受的选择压力不同，使得DNA 分子的不同区域有不同程度的遗传多样性 18。因此，选择适当的DNA 分子遗传标
20、记 ，在属、种、亚种、居群或个体水平上对研究对象进行准确地鉴别，是物种DNA 分子遗传标记鉴别的分子基础。DNA分子作为遗传信息的载体 ，除具有较高的遗传稳定性外 ，还有较高的化学稳定性。不象蛋白质和同功酶那样，在生物体死亡后，很快失去生物活性，并迅速降解。在陈旧标本中所保存下来的DNA仍能够用于 DNA分子遗传标记的研究 ，人们甚至可以从数千年前遗留下来的的古代骨骼标本中提得微量的DNA ，经PCR扩增后对其特定的 DNA片段进行分子遗传标记的研究。昆虫分类学是一门综合性学科，是随着人类认识和利用昆虫的不断深入而发展起来的。上世纪80年代以来分子生物学的迅速发展，在融入系统学与进化研究中形成
21、了一门新兴交叉学科昆虫分子生物学，为昆虫系统学的研究和发展增添了活力 19。将分子生物技术应用于昆虫系统学的研究，它要应用于种及种下阶元的分类鉴定、种上阶元的系统发育分析、分子进化、种群遗传变异及进化的研究 20。四 分子遗传标记在中药学上的应用分子遗传标记技术对中药的研究产生了重要影响，已有人提出分子生药学(Molecular Pharmacog-nosy) 这一新的概念 21。分子遗传标记技术在中药的研究中有以下作用：1： 在生药鉴定上的应用传统的生药鉴定主要依靠颜色、形状、气味、味道和质地等感性特征，这种鉴定方法不准确而且对这些特征的把握因人而异。现代分类学将组织学、形态学和化学法引入到
22、生药鉴定上来，是生药鉴定的一个进步，但这些方法仍有很大的局限性。利用DNA分子遗传标记技术直接分析药材的DNA 多态性，找出真品特有的DNA片段，对此进行测序，进而制备DNA探针，来检测相应的药材 ，是一种便捷、准确的生药鉴定方法 。2： 在药用植物亲缘关系上的应用肖培根院士创立了药用植物亲缘学，采用一些小分子化合物作为鉴定亲缘关系的依据。由于DNA能从本质上反映药用植物的亲缘关系 ，现在很多学者建议把二者结合起来。3： 在药用植物资源与生物多样性保护上的应用目前在研究药用植物资源时，多采用经典的形态分类学方法，用该方法划分物种是建立在个体性状描述和宏观观测水平上，得到的结论往往不完善，易引起
23、争论。 同时这是不科学的，DNA 分子遗传标记技术直接分析遗传物质 DNA 在不同生物个体间的差异，使植物分类和资源的研究更加科学化。4： 在药用植物道地性研究上的应用道地药材具有强烈的地域性，表现在它们往往分布在某些狭小的区域，或虽分布较广但只有某些狭小生境区的质量好、疗效佳、产量最大。药材道地性的原因就是植物的遗传物质DNA 及初生和次生代谢过程中的酶系统发生了 “道地性 ”变化。 道地性药材与非道地性药材毕竟同种，甚至同一亚种，二者在形态和生药性状等特征上，差别往往不明显，给道地药材的鉴别带来了困难。 因此，采用DNA 分子诊断技术并辅以等位酶技术 ，可以从分子水平上来揭示药材的“道地性
24、”。 5： 在遗传育种上的应用药用植物的“优良品种”对药材生产存在着巨大的潜力“， 高含量育种”是药用植物育种的主要目的和特色。 遗传图谱是生物种类的分子档案，对育种工作者有极大的参考价值。 目前应用RAPD 技术已构建了一些重要农作物的遗传图谱。但在药用植物方面还是空白，需加大这方面的研究，为药材的开发利用打下坚实的基础 22。6： 贵重药材及其伪劣品的鉴别我国药用植物种类已上万种，常用的约500种，其中被列为贵重药材的有200种左右，占常用的40%。贵重药材由于价格昂贵，药源不足等原因 ，弄虚掺假现象严重。鉴于DNA 分子遗传标记技术用量少，准确、重现性好等特点，用于贵重药材的真伪鉴别具有
25、很好的应用前景。DNA 分子遗传标记技术虽出现的时间还不长，但在其发展过程中已显露出广泛的应用前景，将对生药学研究的现代化起到重要作用 23。参考文献：1徐刚,遗传标记及其种类(范畴)的发展J.畜牧兽医杂志1995,2: 54- 56.2 BOTSTEIN D,WHITER,SKOLNICK M,et al.Construction of genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphismJ.American Journal of Human Genetics 1980,32:314- 331.3
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