1、1、实验目的：RD 细胞定量检测 miR188;miR657;2、实验材料及试剂：超净台 （上海净化设备厂）生物安全柜 （ESCO，Singapore）,细胞培养箱 （Heraeus，Germany）,分光光度仪 （Eppendorf，Germany）,PCR 仪 （Eppendorf，Germany）,冷冻离心机 （Eppendorf，Germany）,移液枪（Eppendorf，Germany） ， （real-time 试剂盒（takara） ，显微(coic,重庆光学仪器厂） ，计数板；,异丙醇（上海化学试剂有限公司） ，八连管；100%乙醇（上海化学试剂有限公司）,细胞培养液 （Gi
2、bco，USA） ，氯仿（上海化学试剂有限公司）,EDTA-胰酶 （Gibco，USA）,Trizol （Invitrogen，USA）三、实验过程（1）RD 细胞的收集1.培养传代 RD 细胞，待细胞生长状态良好，密度约 80%时进行收集；2.倒掉细胞培养液，加入 1ml 的胰酶于培养瓶中，混匀后将其吸掉（防止消化过度)静置，在显微镜下观察细胞开始变圆（细胞成流沙状流下时） ；.加入 1ml 的培养液，吹打混匀，对其进行细胞计数，按照公式（四个大方格/4)104稀释的倍数=细胞原液量/ml.记录数据。取出 200ul 的该细胞悬液于经DEPC 处理的 EP 管中。（2） Trizol 抽提总
3、 RNA1. 取出上步所收集到的细胞悬液。 2. 加入 1ml Trizol，颠倒 3-4 次，室温静置 10min。3. 每 1ml Trizol 加入 0.2ml 氯仿剧烈震荡 15sec，室温放置 5min。4. 4，12000g 低温离心 15min，此时样品分为三层：上层为无色水相，中间层为白色底层为黄色有机相。5. 吸约 650ul 的上清液于新的 Eppendorf 管。6. 加入等体积 650ul 的异丙醇，颠倒混匀，室温下 20min(-20沉淀 1 小时以上)。7. 4，12000g 低温离心 15min。8. 去上清，加入 1ml 75%乙醇，4，10000g 低温离心
4、8min，重复一次。9. 倒掉乙醇，自然晾干，不可用太大力；室温放置 510min 干燥 RNA 沉淀。10. 用含有 1U/l RNA 酶抑制剂的水 20 l 溶解。11. 收集标记提取出的 RNA,待用；（3）RT1. 注意：做之前要用分光光度仪测定 RNA 的量；水的量要根据实验的具体情况来加，使得最后反应体系是 10ul。在此步的同时要做内参 5sRNA 的逆转录2.反应体系如下：(分开进行，三组反应）HN RT-657HN RT-188-3pR-5SrRNA 80变性 5 分钟，然后迅速在冰上急冻 5 分钟.向反应管中加入：4245min.后 855min 使得逆转录酶失活。（ 四）
5、Real-time PCR1.cDNA 稀释 10ul 水 10ul 水 10ul 水 10ul 水 10ul 水RNA 2.0ul(0.1-1.0g)HN RT-X(1uM) 1.0ul2.5mMdNTP 2.0ul(Final 0.5mM)dH2O 2.0ul5RTBuffer 2.0ulRTase(100-200U/ul） 1.0ulHN miR-X-F(1uM) 1.0ulHN miR-X-R(1uM) 1.0ulcDNA 2.0ul2xSyBGreen Mix 5.0uldH2O 1.0ul10ul 样本40ul 水5 倍稀释 10 20 40 80 160 32010ul 10ul
6、 10ul 10ul 10ul2.稀释好的模板按如下体系进行加样：HN miR-657-F F-5SrRNA HN miR-657-R R-5SrRNA HN-188-3p-FHN-188-3p-R注意：要用 5sRNA 做内参和水做阴性对照；做复孔；10ul 水10ul3.要用到六排八连管，每三排为一组，分别测定 miR188a-3p 和 miR657。样本做两排，做复孔，每一排的第一孔加水做阴性对照；前两排的其余七孔按照上图稀释的倍数按顺序加入不同稀释度的样本反应液；第三排的其余七孔加内参5sRNA 的不同稀释度的反应液，同样的顺序。9510min 95 5s 60 10s40-45 循环
