1、按大小分离 RNA:在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的 RNA 电泳1. 试剂及其配制1) 甲醛（37%-40%溶液，12.3mol/L）：配制 100ml,37-40ml 的甲醛溶液，加入 DEPC 处理的水定容到 100ml。2) 甲酰胺（去离子）3) 10MOPS 电泳缓冲液（ 1L）a) 将 41.8g 的 MOPS 溶解于 700ml 灭菌的 DEPC 处理的水中，用 2N 的NaOH 调整到 pH 值为 7.0。b) 加 20mlDEPC 处理的 1mol/L 的乙酸钠和 20ml DEPC 处理的 0.5mol/L EDTA（pH=8.0） ，用 DEPC 处理的水将溶液的体积调整到
2、 1L。c) 通过一个 0.45um 的微孔滤膜过滤灭菌溶液，同时，将其在室温下避光贮存。4） RNA Loading Buffer (+EB)：TaKaRa2配制含有 2.2mol/L 甲醛的琼脂糖凝胶（100ml 1.5%)1) 称量 0.375g 琼脂糖到 18ml 灭菌水中,用微波炉法溶解琼脂糖，将溶液冷却至 55。2) 加入 2.5ml 10MOPS 电泳缓冲液，4.5ml 去离子甲醛，在化学通风橱中灌制凝胶。3. 处理样品以及 RNA marker向 4l 的 RNA 样品（RNA maker 同理）中加入 4l RNA loading buffer，震荡混匀厚稍离心，然后 65水
3、浴 10min，速冷后即可使用。4. 电泳电泳槽中加入 1MOPS 缓冲液，于 45V/cm 电压下电泳，大约 1h 左右。变性 RNA 在膜上的转移和固定1 转移胶的制备：1) 用 DEPC 处理的水淋洗胶。2) 将胶浸入 5 倍体积的 0.01mol/L NaOH-3mol/L NaCl 中 20min。3) 将凝胶转移至一个玻璃干烤皿内，用锋利的刀片修去凝胶的无用部分以保证胶与膜对齐。4) 用长和宽均大于凝胶的玻璃板作为平台，将其放在大干烤皿内，上面放一张滤纸。5) 于干烤皿内倒入相应的转移缓冲液（带正电荷的膜用 0.01mol/L NaOH-3mol/L NaCl）直至液面略低于平台表
4、面，当平台上方的滤纸完全湿透后，用玻璃棒或移液管赶走所有的气泡。2 转移膜的准备：1) 裁剪和胶一样大小的尼龙膜。2) 将尼龙膜漂浮在去离子水表面直至全部湿透，然后讲膜进入 10SSC 中至少 5min。3 转移系统的安装和 RNA 的转移：1) 将胶倒转后置于平台上的滤纸中央，确保滤纸和胶之间无气泡。2) 用保鲜膜围绕凝胶周边，而不是覆盖凝胶。3) 在胶的上方覆盖湿润的尼龙膜，并确保胶与膜之间无气泡。4) 用相应的转移缓冲液浸湿两张与胶大小一致的滤纸，放于湿润的尼龙膜上，用玻璃棒赶走所有气泡。5) 剪一叠 58cm 厚，略小于滤纸的纸巾，放于滤纸之上，在放一块玻璃板，然后压上 400g 重物
5、。6) 转移过夜。7) 拆除毛细管转移系统，用铅笔标明膜的正面，将膜转移至 50ml 6SSC 中，于摇床上室温轻摇 5min。8) 从 6SSC 溶液中取出凝胶，将多余的液体沥干后，将膜的 RNA 面向上放置于干的滤纸上数分钟。4 RNA 固定在带正电荷的尼龙膜上：待膜在空气中晾干后，将干燥的膜夹在两张滤纸之间，120烤 30minDIG-DNA 标记以及纯化1. 标记探针：1) 加入 1g 的模板的 DNA，然后加入 ddH2O 到 16l。2) 通过煮沸 10min 使 DNA 变性然后快速放入冰浴 10min（完全变性对于有效标记探针很重要） 。3) 混合 DIG-High prime
6、 并加入 4l 到变性的 DNA 中，混合并简单离心，37孵育 2hr。4) 停止反应：65水浴 10min。2. 探针纯化（Mini Column DNA fragment ）：1) 抖动 mini spin，使其中的凝胶混匀，打开标帽，去掉帽尾。2) 将 mini spin 放入一个 Eppendorf 管中，1000g 离心 1min。3) 取新的 Eppendorf 管，将 mini spin 放入管中，将标记好的探针点在凝胶中央，1000g 离心 1min，收集离心后的液体。预杂交及杂交1) 预杂交：预杂交液 5ml 预热到 42，将膜放入杂交瓶中，温育膜 2hr。2) 将预热的 4
7、2 摄氏度杂交液 5ml 放入密闭的塑料袋中，加入探针约250ng（每 ml 杂交液中 50ng 探针） ，混匀。将预杂交后的膜转移到密闭塑料袋中，42杂交过夜。洗膜1) 杂交后，将膜迅速转移至足够的 2SSC，0.1%SDS 中连续震荡两次，每次5min。2) 在 68，用足够的 0.5SSC，0.1%SDS（提前预热到洗涤温度）连续震荡两次，每次 15min。免疫检测（地高辛杂交检测试剂盒 ）1制备试剂盒工作液溶液 组分/制备阻断液 用顺丁烯二酸缓冲液 1:10 稀释 10阻断液，制备成 1工作液抗体溶液 每次使用前，需 10000rpm 离心抗 Dig-AP酶结合物 5min，从表面小心吸取所需的量。用阻断液按 1:5000 稀释抗体显色底物液 加 200l NBT/BCIP 到 10ml 检测缓冲液中2步骤1) 在杂交和严谨洗涤之后，在洗涤缓冲液中浸润 5min。2) 在 10ml 阻断液中孵育 30min。3) 在 10ml 抗体溶液中孵育 30min。4) 在 10ml 洗涤缓冲液中洗涤 2 次，每次 15min。5) 在 10ml 检测缓冲液中平衡 5min。6) 在避光条件下，于 10ml 新鲜制备的显色底物液中反应显色，在此过程中勿摇动。7) 当达到所需的点或带强度后，用 TE-缓冲液洗膜 5min。
