1、组分Component用量（L ）volume（L）10PCR buffer 2.5 MgCl2 (25mM) 3.0dNTP(10mM each) 0.5rTaq DNA Polymerase (5U/L)0.2Upstream primer(10M) 0.5Downstream primer(10M) 0.5DNA Template(20ng/L) 2.0dd-H2O 15.8Final volume 25.0反应扩增程序为：94预变性 5min，94变性 1min，35退火1min，72延伸 1min，5 个循环；94变性 1min，50退火 1min，72延伸1min，35 个循环，最
2、后 72延伸 10min。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析SRAP 扩增产物在 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，显影步骤参照陈明亮等(2007) 207的方法略有改动。具体如下：电泳分析采用 20cm20cm 的竖直板电泳槽进行。电泳液为 1TBE。电泳参数：恒压 280V，约 2.5h。SRAP 扩增产物上样量 4.0L，分子量 marker 上样量：1.0L。 电泳完毕，剥胶，进行银染分析，具体操作如下：(1). 将凝胶于 250mL 固定液（10乙醇， 0.5%冰乙酸）中固定15min；（固定液可重复利用数次，每次固定之前再加 20mL 左右 5固定液）(2). 在 0.2 % 的硝酸银渗透液中渗
3、透 30s；（银染液可重复利用，新配的可染时间短些，用过几次后染色时间根据情况相应延长）(3). 蒸馏水漂洗 30s；(4). 在显色液（ 1.5%NaOH，0.4甲醛）中显色至条带清晰；(5). 自来水冲洗照相，以做分析。 （用保鲜膜封起来，4可保存数月）2.2.2.7 差异片段的聚丙烯酰胺凝胶回收与再扩增（1） 特异片段的分离和二次扩增 用干净的刀片将特异片段从聚丙烯酰胺凝胶上切下置于离心管中，灭菌双蒸水洗 3 遍后，加 100L 10PCR buffer 于 50下温浴 30min，-20过夜。沸水浴 20min，然后稍离心，上清转入新离心管，加入等体积预冷的异丙醇，-20沉淀 30mi
4、n。4，12000 r/min 离心 20min，用 75%乙醇洗沉淀，将沉淀风干 510min，最后溶于 20L 灭菌双蒸水，用作模板，用与上述 PCR 相同的引物及体系再次进行扩增。为了增加回收产物的量，可将原反应体系依比例扩大二倍。扩增程序为 94 2min；94 30s，50 30s，72 60s，共 35 个循环；72 10min。（2） 目的片段的回收和纯化 将二次扩增的产物用 1.0%琼脂糖凝胶分离，在紫外灯下切下目的片段，用纯化试剂盒（上海生工 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒）纯化。回收和纯化的程序具体如下：A. 切取含目的 DNA 片段的凝胶薄片，按 400L/1
5、00mg 琼脂糖凝胶的比例加入 Binding Buffer II，置于 55C 水浴约 15min 直至凝胶完全熔化，期间每两分钟混匀一次；B. 将融化的胶溶液转移到套置在 2mL 收集管内的 UNIQ-10 柱中，室温放置2 分钟，6000r/min 室温离心 1min；（对于小于 500bp 的 DNA 片段，强烈建议将离心下来的液体重新加入原 UNIQ-10 柱中，6000r/min 离心1min）C. 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放入同一个收集管中，加入 500L Wash Solution，8000r/min 室温离心 1min；D. 重复步骤 C 一次；E. 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放入同一个收集管中，12000r/min 室温离心 2min；F. UNIQ-10 柱放入一根新的 1.5mL 离心管中，在柱子膜中央加 40uL Elution Buffer 或水（PH7.0） ，室温或 37C 放置 2min；（提高洗脱温度到5580C 有利于提高 DNA 的洗脱效率）G. 12000r/min 室温离心 1min，离心管中的液体即为回收的 DNA 片段。可立即使用或保存于-20C 备用。
