1、奶粉中三聚氰胺的测定方法发布时间：2008 年 9 月 22 日GC-MS 法测定动物食品中的三聚氰胺Spectra-Quad 实现三聚氰胺含量在线检测超高效液相色谱_电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺反相高效液相色谱法测定饲料中三聚氰胺的含量高效液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺高效液相色谱法(HPLC)测定饲料中三聚氰胺的含量高效液相色谱-四极杆质谱联用测定饲料中三聚氰胺含量固相萃取与高效液相色谱联用测定宠物食品中三聚氰胺液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)分析宠物食品中三聚氰胺液相色谱-串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留GC-MS 法测定动物食品中的三聚氰胺测定方法本实
2、验中综合各方法稳定性进行比较，主要介绍以下三种： 固相萃取（SPE）方法 HPLC-UV 检测方法 LC-MS 检测方法（仅供参考）检测中所需的仪器与条件 Agilent1100 高效液相色谱仪(美国，Agilent 公司) ；二极管阵列检测器 (DAD)，检测波长 240nm，柱温：40。(1)AgelaVenusilTMASBC18(4.6250mm)；缓冲液：10mM 柠檬酸,10mM 庚烷磺酸钠;流动相：缓冲溶液：乙腈=85：15；流速：1.0mL/min。(2)AgelaVenusilTMASBC8(4.6250mm)；流动相：缓冲液：乙腈=85 ：15；缓冲液：10mM 柠檬酸，1
3、0mM 辛烷磺酸钠，调 pH 为 3.0;流速：1.0mL/min； 离子交换固相萃取柱 AgelaClearnertTMPCX(北京艾杰尔科技有限公司)混合型的阳离子交换柱(Cleanert PCX 60mg/3mL)50 支 台式高速（微量）离心机 TG16-WS/TG16-W (湖南湘仪离心机仪器有限公司)（1）角转子: 121.5ml；1210ml 转速8000rpm/min，微机控制可定时；常温（2）离心管：10ml.或 1.5ml（一套） 三聚氰胺标准品 1 瓶(250mg,99.5) 三聚氰胺分析方法手册份其他试剂饲料/奶粉样品；甲醇、乙腈；氨水、乙酸铅、三氯乙酸、柠檬酸、庚烷磺
4、酸钠 、辛烷磺酸钠(Sigma 公司)；甲醇为色谱纯，其他均为化学纯。理化性质 三聚氰胺:英文名“melamine“,简称三胺,学名三氨三嗪,别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3: 分子量:126.12物理性能:白色结晶粉末,无毒 ,无味;相对密度:1570kg/m 3;熔点:在常压下,354分解;升华温度：300;溶解性:能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳、苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性化学性能：三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚酸二酰胺盐；在强酸或强碱液中，三聚氰胺
5、发生水解，胺基逐步被羟基取代，处成三聚氰酸二酰胺、三聚握酸一酰胺和三聚氰酸；三聚握胺与醛类反应生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂，三聚氰树脂是一种多种用途的材料，防水耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具，防炎纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂。固相萃取（SPE）方法1 固相萃取（SPE）柱的选择： 三聚氰胺呈弱碱性（弱阳离子化合物） ，净化过程一般选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱（PCX ）通过将磺酸基因（-SO 3H）键何在极性高聚物聚苯乙烯 /二乙烯苯（PEP）吸附剂上，具有阳离子和反相两种吸附机理，并具有以下优点：1) 可通过两种不同溶液的洗涤（水
6、/一定 pH 值的缓冲溶液和有机溶剂） ，使样品更干净，提高检测的灵敏度。2) 批次重复性好。3) 回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。图 PCX 结构式2 样品前处理步骤：2.1 标准样品配制：取 50mg 三聚氰胺标准品，以 20%甲醇溶解定容至 50ml 得到 1000ppm 的标准溶液，使用时，以提取液（1%三氯乙酸）稀释至所要的浓度。2.2 提取称取饲料/奶粉样品 5g （或牛奶 10ml） ，加入 50ml 1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2ml 2%乙酸溶液，超声 20min。然后取部分溶液转移至 10ml 离心管中，并将其放置于离心机中，启动离心机使转速达到
7、 8000rpm/min 离心 10min 后，取上清液 3mL 过混合型阳离子交换小柱（PCX） 。 2.3 净化（PCX 小柱，60ml/3ml）：1） 活化及平衡： 3ml 甲醇 ，3ml 水2） 上样：加入提取液 3ml3） 淋洗：3ml 水；3ml 甲醇：弃去淋洗液并将小柱抽干。4） 洗脱：5ml 5%氨化甲醇（v/v ）洗脱。 （5%氨化甲醇的配制：5ml 氨水+95ml 甲醇） 。5) 浓缩：50C,氧气吹干，20%甲醇/水定容至 2ml。HPLC 分析或衍生后 GC/MS 分析。HPLC-UV 检测方法三聚氰胺在传统的 C18 柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的
8、保留与分离，按照美国食品药品监督管理局（FDA）的三聚氰胺检测方法和中国农业部颁部的三聚氰胺检测方法，采用 Venusi ASB 系列亲水色谱柱，均能得到良好的结果，分析色谱图如下： 1、 三聚氰胺的 FDA 检测方法色谱柱：Venusil ASB C8 4.6250mm 缓冲液：10mM 辛烷磺酸钠，调 Ph 为 3.0流动相：缓冲液：乙腈=85：15进样量：样品用缓冲液溶解成约 0.1mg/mL,进 10uL流 速：1.0Ml/min柱 温：40 C波 长：240nm2、三聚氰胺的中国农业部颁标准检测方法色谱柱：Venusil ASB-C8 4.6250mm 缓冲液：10mM 柠檬酸，10
9、mM 庚烷磺酸钠流动相：缓冲溶液：乙腈=85：15进样量：样品用缓冲液溶解成约 0.1mg/mL,进 10uL流 速：1.0Ml/min柱 温：40C波 长：240nm表 1 PCX 柱回收率添加水平（mg/L） 回收率空白 0.01 116%0.1 108%0.5 92%2 96%由上表 1 可以看出：用 PCX 柱净化样品，可以得到满意的回收率，此方法处理样品，比FDA 公布的前处理方法更加准确、可靠。LC-MS 参考方法 LC-MS 方法检测三聚氰胺的谱图 由于 FDA 公布的 HPLC-UV 方法中，流动相添加了离子对试剂，限制了液质联用方法的使用；但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在
10、传统的 C18 柱上保留很差，没有良好的保留与分离。 源于此问题采用 Venusil ASB 系列亲水色谱柱，不用离子对试剂也能得到有效的保留与分离，参考方法如下：缓冲液：10mM NH4AC流动相：缓冲液：ACN=95： 5进样量：先用 70%ACN 溶解成约 1mg/mL,用 CAN 稀释成 1.0mg/mL,进 10uL柱 温：40C波 长：240nm 与 FDA2007 年 4 月公布的UpdatedFCCDevelopmentalMelamineQuantitation(HPLC-UV) 相比较，该方法大大降低了最低检测限(MSD：0.5ppm；UV ：2ppm)，提高了检测灵敏度。
11、以该方法分别在 ASB-C84.6250mmASB-C184.6250mm 得到的谱图如下：结果与讨论阳离子交换柱(PCX)三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物 )，净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO3H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理，并具有以下优点：a)可通过两种不同溶液的洗涤( 水/ 一定 pH 值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度。b)批次重复性好。c)回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。国家食品质量监督检测中心有关人士称，在现有的国家标准奶粉检测中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。也就是说，三聚氰胺不属于常规检测项目，正常情况下，很少有人会想到去检测它。
