1、PDC ADH PDC AIDH B1 B1 NA NA B1 NA NA LDH ACS Pdx Pdx 丙酮酸发酵实验 1.实验目的 学习掌握利用发酵法生产丙酮酸的原理 ，掌握丙酮酸、残糖和菌体浓度的测定方法 和工艺操作。 2.实验原理 丙酮酸是机体代谢的中间产物，既处于糖酵解（ EMP）途径的末端，又是连接 EMP 途径和 TCA 循环的关键产物，它可经多条途径生成乙醇、乳酸、草酰乙酸、丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸等。因此其所处的位置极为特殊。根据代谢控制育种和发酵原理，要想在生物体内大量积累丙酮酸，就必须进一步切断或更确切地说是减弱丙酮酸的进一步代谢支路，加速丙酮酸的合成速度，去除代谢产物
2、的反馈阻遏或反馈抑制（图 1）。 图 1 丙酮酸的代谢途径及发酵机制 加速代谢流 切断或减弱 圈内为辅酶或辅基（ NA 表示烟酸， B1 为硫胺素，Bio 为生物素， Pdx 为吡哆醇。 甘油 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸 乙酰辅酶 A 乙醛 乙醇 乙酸 -酮戊二酸 草酰乙酸 NA 乳酸 异亮氨酸，缬氨酸 丙氨酸 谷氨酸 谷氨酰胺 葡萄糖 3 实验仪器与材料 5L 自动控制发酵罐 TGL-16G 台式高速离心机 752 型紫外可见分光光度计 500mL 三角瓶 HZQ-Q 恒温振荡器 手提式压力蒸汽灭菌器 LRH-250A 型生化培养箱 SBA-40C 型生物分析传感仪 实验菌种： 烟酸、硫氨酸、
3、生物素和吡哆醇缺陷型的 光滑球拟酵母（ Torulopsis glabrata） 种子培养基 (g/L)：葡萄糖 30，蛋白胨 10， KH2PO4 1， MgSO47H2O 0.5， pH 5.6，自来水 1L。 发酵培养基 (g/L)：葡萄糖 80g/L，蛋白胨 3g/L，硫酸铵 5.9g/L， KH2PO4 1g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，烟酸 8mg/L，盐酸硫胺素 20g/L，生物素 10g/L，盐酸吡哆醇 0.5mg/L，金属离子母液 5mL/L， pH 5.6。 金属离子母液： CaCL22 H2O， 2g， FeSO47H2O， 2g； ZnCL2， 5g， MnC
4、L4H2O，0.2g， CuSO45H2O， 0.5g， 2mol/L HCL 溶解后定溶至 1L。 4 实验步骤与方法 （ 1） 种子培养 取新鲜斜面菌种 1 环，接入 50 mL 种子培养基（ 500mL 锥形瓶）中， 30 ，200r/min 振荡培养 20 小时。 （ 2） 5L 罐分批发酵实验 空消：空罐灭菌。 实消：将发酵培养基 2.7L 从进样口倒入 5L 发酵罐中，盖上盖子。检查发酵罐安装完好后，盖上灭菌罩， 105 灭菌 15 分钟。 校正：校正 pH 电极、溶氧电极（校正方法参考 5L 罐使用说明书） 接种与发酵：在接 种圈的火焰保护下，将种子培养液 300mL 倒入发酵罐
5、中，控制发酵温度 30 ， pH 为 6.0, 溶氧 :0-12h 通风 60L/h，发酵罐搅拌 100r/min，12-72h停止通风和搅拌。自动流加 8mol/L NaOH 溶液控制发酵液 pH 为 5.00.05，发酵过程产生的泡沫较多时，手动加入已灭菌的泡敌 2-3 滴即可迅速消泡，当残糖浓度低于 5g/L 时发酵结束。 测量：每隔 4h 取样，测菌体浓度、葡萄糖和丙酮酸浓度。 在火焰下，按 10%(v/v)接种量将种子接入发酵罐中，装液量 3L，通风量 1 L/(Lmin)，发酵温度 30 ，通过调节搅拌转速控制溶氧 (DO)： 1-12h 控制溶氧值为 80100%， 12 控制溶
6、氧值为 70-80%。自动流加 8mol/L NaOH 溶液控制发酵液 pH 为 5.00.05，发酵过程产生的泡沫较多时，手动加入已灭菌的泡敌 2-3 滴即可迅速消泡，当残糖浓度低于 5g/L 时发酵结束。 （ 3） 分析方法 菌体干重的测定 将含有 4mL 发酵液的塑料离心管置于台式离心机中，于 10000 r/min 下离心5min,放于电热鼓风干燥箱 80 烘干至衡重，计算出细胞干重。上清液用于测定残糖浓度、丙酮酸浓度。 葡萄糖的测定 用 SBA-40C型生物传感仪检测。将离心后的上清夜稀释适当的倍数 (100倍 )，用进样器吸取 25L进样。 丙酮酸的测定 取 10mL 丙酮酸发酵液
7、，离心（ 4000r/min,10mL）除去菌体，取 5mL 离心后的上清液至于 500mL 容量瓶中，再加入 5mL 0.01mol/L 的硫酸溶液进行酸解，使有机酸游离出来，然后定容并取适量以 0.45m 孔径的滤膜过滤即得到待测样液。 采用反相色谱柱 ODS-2 HYPERSIL(250mm4.6mm， 5m)， 以 0.05mol/L NH4H2PO4 （ 用 H3PO4调 pH2.6） 作为流动相，在流速 1mL/min， 波长 215nm 下测定 。 5 实验数据处理 发酵培养时，按照一定的时间间隔取样测定并记录，结果如下表。 时间 h 葡萄糖浓度 /(g/L) 菌体干重 /(g/
8、L) 丙酮酸浓度 /(g/L) 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 6 结果与讨论 （ 1） 按照上表给出的相应数据，以时间为横坐标，表中数据为纵坐标绘图，分析各量的变化 规律。 （ 2） 糖酸转化率 (%)：生成丙酮酸的克数与消耗葡萄糖克数之比的百分数。 7. 参考文献 （ 1）高年发 张现青 溶氧对发酵丙酮酸的影响 J天津 . 天津科技大学学报 vol9.No.3. 2004. （ 2） 楼良旺 高年发 紫外分光光度法测定丙酮酸 J北京：分析实验室 .vol24.No.4.2005. （ 3） 高年发 吴迪 张健 反相高压液相色谱法测定丙酮酸发酵液中丙酮酸J天津 .天津科技大学学报。 Vo21.No.1. 2006. （ 4） 占桂荣 高年发不利用丙酮 酸的丙酮酸生产菌的选育 J生物加工过程 .Vo4.No.4. 2006. 8. 预习与思考 请预习 紫外分光光度法测定丙酮酸、反相高压液相色谱法测定丙酮酸发酵液中丙酮酸、不利用丙酮酸的丙酮酸生产菌的选育并思考： （ 1） 光滑球拟酵母发酵产生丙酮酸的机制是什么？发酵培养基配制的要点有哪些？ （ 2） 光滑球拟酵母丙酮酸发酵的条件控制要点是什么？
