1、 副溶血性弧菌（ Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。 第一节 副溶血性弧菌标准的检验方法 一、检验方法 （一）操作步骤 1. 分离培养：首先称 取样品 25g，加 225mL3.5灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各
2、一个，同时取 10mL 加入 100mL 增菌液中，放 37 816h 培养后，涂上述平板进行分离， 37培养 1824h 取出观察，挑取可疑菌落，转种 3.5氯化钠三糖铁斜面， 37、 24h 观察结果。 2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。 3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水 （ 0， 3， 7， 10）于 37 24h 培养后观察生长情况，在无盐和 10盐的胨水中不生长，在 3和 7盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。 4. 生化试验：分别
3、接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、 V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放 37培养，除 V-P、靛基质和甲基红试验培养 48h 后加试剂观察外，其他均在 24h 观察结果。 5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种 3.5氯化钠胨水，经 37、 1618h 培养后，小鼠腹腔注射 0.3mL，观察 23d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。 （二）检验程序 图 6-1 副溶血性弧菌检验程序 二、结果分析判定及注意事项 （一）样品处理 采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，
4、副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。 对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为 有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。 样品经增菌 816h 后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有 3.5盐的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于 5 个，尤其夏季海产食品混放，相互污染严重，时有不同型别的大量细菌存在，以防漏检。 （二）形态与染色 为 革兰氏阴性 无芽胞杆菌，易呈多形态，有棒状、弧状、卵
5、圆状、球状、丝状等，排列不规则，多数散在，偶而有成对排列，一般大小为 0.30.7 m 12 m，单端一根鞭毛，有动力，运动活泼，两端浓染，在固体培养条件下能生长周鞭毛。 （三）培养 特性 在普通琼脂培养基和普通液体培养基中都可生长，在无盐的条件下不生长，在含 2 3氯化钠的培养基中生长最旺盛，氯化钠溶液浓度到达 10以上时不繁殖。 在肉汤和胨水等液体培养基中混浊生长，需氧性强，常在液体表面形成菌膜，在液体培养条件下菌体多生长为单鞭毛，运行活泼。在固体培养基上，菌落常为隆起，圆形，稍混浊不透明，表面光滑，湿润，不产生色素。在比较新鲜湿润或软琼脂培养基上，有些副溶血性弧菌可形成不规则菌落或片状扩
6、散生长，在 0.7以上琼脂的培养基上能生长周鞭毛（侧毛）。一般在 2025培养生长的周鞭毛较 为稳定，而在 37培养或 24h 以上的培养物，周鞭毛易于由菌体自发脱落，具有周鞭毛的菌株，在固体培养基上多表现扩散生长，单鞭毛的菌株在固体培养基上呈典型菌落，不表现扩散生长。 培养基的成分、种类、温度、湿度等条件的不同，都能对扩散生长有所影响，菌落形态也容易受条件的影响有所改变，如在嗜盐性平板上一般生长良好，而在 SS 琼脂平板上多呈较小的扁平菌落，不易挑起。在血平反上生长快可出现溶血环，在 BCBS（硫代硫酸盐，柠檬酸盐，胆盐，蔗糖）和氯化钠蔗糖琼脂平板上，呈淡蓝或蓝绿色菌落。一般由腹泻病人初期分
7、离者多为典型菌落 ，长期保存的细菌或条件不适宜时，常有菌落变粗糙，形状不整齐或菌落出现解离，有的在液体培养时呈沉淀生长现象。 pH 生长范围为 510，最适 pH 为 7.28.2，发育最适温度为 3037。 （四）生化特性 本菌对葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇， 产生靛基质，不产生硫化氢，甲基红阳性，V-P 阴性，赖氨酸阳性，精氨酸阴性，鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性，溶血性多数阳性，有少数不溶血，主要生物化学性状见表 6-1。 近年来由于细菌学基础研究的深入和检验技术的进步，逐渐对一些海水来源的嗜盐性弧菌有所认识，对 其主要生化学性状与副溶血性弧菌的比较见表 6-2。 表 6
8、-1 副溶血性弧菌的主要生物化学性状 项 目 项 目 耐盐性 0 甲基红 7 v p 10 靛基质 葡萄糖产酸 赖氨酸 葡萄糖产气 鸟氨酸 / 蔗糖 精氨酸 甘露醇 溶血性 / 硫化氢 注：阳性；阴性； /多数阳性，少数阴性。 表 6-2 副溶血性弧菌与 其他弧菌的鉴别 菌名 氧 化 酶 葡 萄 糖 产 赖 氨 酸 精 氨 酸 鸟 氨 酸 靛 基 质 明 胶 液 化 v ！ p 乳 糖 蔗 糖 甘 露 醇 肌 醇 阿 拉 伯 糖 甘 露 糖 鼠 李 糖 半乳 糖 硝 酸 盐 泳 动 盐胨水， 气 苷 0 6 8 10 副溶血性弧菌 v.parahaemoly-ticus d d 溶藻弧菌 v.
9、alginolyicus d o1霍乱弧菌 v.choleraeo1 d (d) d 非 o1霍乱弧菌 v.cholerae nono1 d (d) d d d 拟态弧菌 v.mimicus (d) d 河弧菌 v.fluialis d d d d d 创伤弧菌 v.ulnificus d d d 梅氏弧菌 v.metschnikouii d d d d d d d 霍利斯弧菌 v.hollisae d v.damsela d d 注： 90以上为阳性； 90以上为阴性；（）迟缓阳性； d 11 89为阳性；（ d） 1189迟缓阳性。 （五）溶血性试验 我妻氏用高盐血琼脂培养基，在限定的条件
10、下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应，称此溶血性能为“神奈川现象”。 此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板，经 37、 24h 培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性，若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象”阴性。 有致病性的副 溶血性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。 （六）动物试验 经上述检验的可疑菌株，用小鼠测定毒力，将 1618h 的蛋白胨水或肉汤培养物，注射小鼠腹腔 0.30.5mL，有毒力者可在 510h 发病死亡，长者有 24h 左右发病死亡。发病时有竖毛、运动不活泼，腹部紧贴罐底，呼吸困难，四肢抽搐、尾部
11、痉挛震颤等症状。将死亡小鼠解剖后，取心血等内脏进行分离，可检出试验菌的纯培养。对照动物观察 23d 无异常现象。 但应注意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有时不易区别，需要上述毓的检验后，进行毒力证实，综合判定 结果。 三、培养基 （一）氯化钠结晶紫增菌液 成分：蛋白胨 20g 氯化钠 40g 0.01结晶紫溶液 5mL 蒸馏水 1000mL pH9.0 制法：除结晶紫外其他按上述成分配好，加热溶解，约加 3氢氧化钾溶液 4.5mL，校正 pH，加热煮沸，过滤，再加入结晶紫溶液，混合分装试管， 121高压灭菌 15min。 （二）氯化钠蔗糖琼脂 成分：蛋白胨 10g 牛肉膏 10g 氯化钠
12、 50g 蔗糖 10g 琼脂 18g 0.2溴麝香草酚蓝溶液 20mL 蒸馏水 1000mL pH7.8 制法：将牛肉膏、蛋白胨及氯化钠溶解于蒸馏水中，校正 pH，加入琼脂，加热溶解，过滤，加入指示剂，分装烧瓶 100mL， 121高压灭菌 15min 备用。临用前在 100mL 培养基内加入蔗糖 1g，加热溶化，冷至 50倾注平板。 （三）嗜盐菌选择性培养基 成分：蛋白胨 20g 氯 化钠 40g 琼脂 17g 0.01结晶紫溶液 5mL 蒸馏水 1000mL pH8.7 制法：除结晶紫和琼脂外，其他按上述成分配好，校正 pH，加入琼脂，加热溶解，再加结晶紫溶液，分装烧瓶，每瓶 100mL。
13、 （四） 3.5氯化钠三糖铁琼脂 成分：蛋白胨 20g 牛肉膏 5g 乳糖 10g 蔗糖 10g 葡萄糖 1g 氯化钠 35g 硫酸亚铁铵 0.2g 硫代硫酸钠 0.2g 琼脂 12g 酚红 0.025g 蒸馏水 1000mL pH7.4 制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正 pH，加入琼脂，加热煮沸使琼脂溶化，加入 0.2酚红溶液 12.5mL，摇匀，分装试管， 121高压灭菌 15min，放置高层斜面备用。 （五）氯化钠血琼脂（我妻氏培养基） 成分：酵母膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 70g 磷酸氢二钠 5g 甘露醇 10g 结晶紫 0.001g 琼脂 15g 蒸馏水 1
14、000mL 制法：调 pH8.0，加热 30min（不必高压），待冷至 45左右时，加入新鲜人或兔血（ 5 10），混合均匀，倾注平皿。 （六）嗜盐性试验培养基 成分：蛋白胨 2g 氯化钠 按不同量加入 蒸馏水 100mL pH7.7 （七） 3.5氯化钠生化试验培养基 成分：牛肉膏 5g 蛋白胨 10g 氯化钠 35g 磷酸氢二钠 2g 0.2溴麝香草酚蓝溶液 12mL 蒸馏水 1000mL pH7.7 制法：将上述成分配好后，根据所需的糖发酵管分别加入各种糖类，葡萄糖发酵管可按 0.5葡萄糖加入后，分装有小倒管的试管内， 121高压灭菌 15min。其他培养基可分装为每瓶 100mL， 1
15、21高压灭菌 15min，另将各糖类分别配好 10溶液，同时高压灭菌后，取 5mL 糖液，加入 100mL 培养基内，以无菌操作分装小试管。 （八）葡萄糖食盐胨水（ MR-VP 试验用） 成分：多胨 5g 葡萄糖 5g 磷酸氢二钾 5g 氯化钠 30g 制法：加入 1000mL 蒸馏水，振摇加热，使全部溶解，冷却后分装小试管， 121高压灭菌 15min。 （九）食盐胨水（靛基质试验用） 成分：蛋白胨 20g 氯化钠 30g 蒸馏水 1000mL pH7.4 制法：按上述分配制，分装小试管， 121高压灭菌 15min。 （十）运动性试验培养基 成分：牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 30
16、g 琼脂 4g 制法：将全部成分加入 1000mL 蒸馏水，加热溶解，分装试管， 121 15min 高压灭菌，最终 pH7.4。 第二节 副溶血性弧菌参考检验方法 一、日本食品微生物检验方法 （一）分离、菌数测定 图 6-2 分离、菌数测定程序 （二）鉴定 将 TCBS 平板上生长典型或可疑的菌落挑取 2 个以上，接种以下培养基： 图 6-3 鉴定程序 （三）检查用培养基 1. 3氯化钠蛋白胨稀释液：蛋白胨 10g、氯化钠 30g 溶于 1000mL 蒸馏水中，校正 pH7.0， 121 15min 高压灭菌。 2. TCBS 成分：酵母膏 5g 蛋白胨 10g 蔗糖 20g 硫代硫酸钠 1
17、0g 柠檬酸钠 10g 牛胆酸钠 3g 牛胆汁粉 5g 氯化钠 10g 柠檬酸铁 1g 溴麝香草酚蓝（ 2溶液） 20mL 草酚蓝（ 1溶液） 4mL 琼脂 15g pH8.6 制法：将上述成分加蒸馏水至 1000mL，混合，使全部溶解，校正 pH 为 8.6，加热煮沸，不需高压灭菌，倾注平皿 1520mL。 不分解蔗糖的副溶血性弧菌，在此培养基上生长呈蓝绿色菌落，分解蔗糖的细菌呈黄色菌落。 3. 我妻氏琼脂（改良）培养基 成分：酵母膏 5g 蛋白胨 10g 氯化钠 70g 甘露醇 5g 结晶紫（ 0.1酒精溶液） 1mL 琼脂 15g 制法：将全部成分溶于 1000mL 蒸馏水中，调正 pH
18、 为 7.5，至完全溶解后，加热煮沸数分钟，不需高压灭菌，冷却至 50时，加入洗净的 20浓度的人红血球悬液 100mL，混合均匀后倾注平皿。 红血球悬液的制备：将人的脱纤维血液，离心沉淀的血球，用 0.85灭菌生理盐水洗 3 次，最后沉淀的红血球，用生理盐水制成 1:4 的悬液。 4. 亚硫酸铋肉汤 成分：蛋 白胨 10g 氯化钠 25g 氯化钾 0.7g 氯化镁 5g 制法：加蒸馏水 950mL 溶解，调 pH 为 9.1， 121高压灭菌 15min，室温冷却，加亚硫酸铋溶液 100mL 及95酒精 1mL，混匀，无菌手续加入灭菌试管，每管 100mL，不需加热。 亚硫酸铋溶液配制：热水
19、 100mL，加亚硫酸钠 20g；热水 100mL 加柠檬酸铋铵 0.1g；将加溶解甘露醇 20g，煮沸 1min，最终成白色混浊的混合物，使用前摇匀。于冷库贮存，可使用 1 个月。 5. 食盐碳 水化合物肉汤基础液 成分：蛋白胨 2g 硫酸钠 2.5g 氯化铵 5g 磷酸二氢钠 0.5g 磷酸氢二钠 1.5g 0.2溴麝香草酚蓝溶液 12mL 制法：将全部成分溶于 1000 人工海水中，分装试管，每管 5mL， 121 15min 高压灭菌，冷却后分别加碳水化合物 10灭菌溶液 0.5mL。碳水化合物溶液需过滤或 115 10min 高压灭菌。 人工海水的配制：氯化钠 23.4g，氯化钾 0
20、.66g，硫酸钠 3.91g，重碳酸钠 0.19g，氯化镁 4.96g，将上述全部成分溶于 1000mL 蒸馏水。 6.Hugh-Leifson 食盐培养基 成分：蛋白胨 2g 氯酸钠 30g 磷酸氢二钾 0.3g 葡萄糖 10g 琼脂 4g 0.2溴麝香草酚蓝溶液 12mL 蒸馏水 1000mL pH7.4 制法：将上述成分溶解，调 pH 后加指示剂，分装试管，每管 3mL， 121高压灭菌 15min。 试验方法： 穿刺接种两种，一管加矿物油覆盖表面，于 3537培养，两管同时变黄为葡萄糖发酵，只有不加矿物油的培养管变黄时为葡萄氧化。 二、耐热溶血毒检验方法 根据试验证明，神奈川现象阳性菌
21、株，多数对人的致病性有密切关系，神奈川现象的阳性物质称“耐热性溶血素”，检验副溶血性弧菌是否产生耐热性溶血毒，可参考下述方法： （一） Sahuria（樱井氏）法 用副溶血性弧菌肉汤培养物上清液为抗原，与制备的精制耐热性溶血毒的抗血清进行琼脂扩散试验，观察沉淀线。 （二） Elek 法（本田改良法） 以微研 No.1 琼脂（ Difco 胨 30g，磷酸氢二钠 30g，氯化钠 40g，葡萄糖 5g，琼脂 15g，蒸馏水 1000mL，pH7.3）培养 37过夜，在平板上菌落旁约为 5mm 处放一小滤纸片（上吸有抗血清），室温放一夜，观察滤纸旁有无沉淀红。 （三）液体培养检验法（饭田民） 用 2
22、氯化钠肉汤，加入少量新鲜红血球，倾斜培养，神奈川现象阳性菌株能引起溶血，而阴性菌株不溶血。 （四）反相被动血球凝集法（太田氏） 用吸附抗体的红血球测定抗原（溶血毒），此方法极为敏感，可查出微量耐热性溶血毒。并发现神奈川现象阴性的菌株也产生少量的耐热性溶血毒。 三、至病性 试验方法 （一）兔肠袢结扎试验 选用正常健康家兔，首选使家兔断食 24h，用乙醚麻醉，将腹壁切口，露出小肠，选取肠段约 5cm 左右，于两端结扎，注入检菌的肉汤培养物，同时另选两段作阳性和阴性对照，然后迅速缝合， 24h 后由耳静脉注入空气杀死，开腹检查，有致病性者注菌肠段可见肿胀积液，出现坏死现象。 一般认为神奈川现象阳性菌
23、株，兔肠袢结扎试验多数为阳性反应，神奈川现象阴性菌株多数为阴性，但亦有少数为阳性者。 （二）新生兔经口试验 选用 12 日龄的新生家兔，将检菌的培养物经口喂入 12mL，有致病性者一般可在 1020h 发病，初期症状蜷缩不动，随后呈极度疼痛状，翻滚嚎叫，呼吸急促，痉挛，多数在 24h 左右死亡，解剖可见内脏充血现象。 无毒株不发病，可对致病性副溶血性弧菌与非致病性溶藻弧菌进行鉴别。 四、血清学检验 进行副溶血性弧菌血清学鉴定时，可用 O 抗原分群，将 18-24h 的培养物，用 3食盐水作成较浓的菌悬液，121高压 1h 或 100煮沸 后，用此菌悬液进行 O 抗血清玻片凝集试验，同时用无菌生
24、理盐水作对照，如O 凝集反应阳性时，可用不经加热的菌悬液进行抗血清玻片凝集反应分型判定。 副溶血性弧菌有三种抗原，即 O 抗原（菌体抗原），抗原（荚膜抗原）及抗原（鞭毛抗原），日本泷川氏和坂崎氏，根据对本菌血清学特性的研究，经逐年的进展，将副溶血性弧菌分出 11 个 O 群， 60 个 K型， 63 个血清型。关于抗原，因与其他弧菌有共同性，至今在血清型别的分类上没有利用。副溶血性弧菌的抗原组合见表 6-3。 表 6-3 副溶血性弧菌的抗原组合 o 群 k 型 1 1， 25， 26， 32， 38， 41， 56， 58a， 64 2 3， 28 3 4a， 5， 6， 7， 29， 30 a， 31， 33， 37， 43， 45， 48， 54， 57， 58 a， 59 4 4 a， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 34， 42， 49， 53， 55， 63 5 15， 17， 30 a， 47， 60， 61 6 18， 46 7 19 8 20， 21， 22， 39， 62 9 23， 44 10 19， 24， 53 11 36， 40， 50， 51 总计 11 60k 型 /63 血清型
