1、The effect of fungus fermented liquid on the output of Streptomyces natalensis natamycin Author: instructor: (2009 College of life science of Anhui agricultural University -level biotechnology class 1, 09121012,) Abstract: Natamycin is a broad-spectrum antifungal agent generated by the fermentation
2、of the streptomyces natalensis,streptomyces gilvosporeus,streptomyces chattanoogensis and other strains.It can be used as biological preservatives because it has low toxicity and change food taste lightly.This experiment adopts the methods of adding Fungal fermentation broth to streptomyces natalens
3、is N5 strains to improve natamycin production of the strains.The results reveal that Fermentation broth of Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae can all improve Production of natamycin well.It has the best effect on the improvement of the synthesis of natamycin when Pe
4、nicillium chrysogenum and Aspergillus niger are cultured for one day.However,Saccharomyces cerevisiae has the best effect of improvement when culture for three days,and when the production of natamycin is one time higher than samples without treatment of fungal fermentation broth. Key words: natamyc
5、in productivity Penicillium chrysogenum Aspergillus niger Saccharomyces cerevisiae 真菌发酵液对纳塔尔链霉菌纳他霉素产量的影响 摘要：纳他霉素是由纳塔尔链霉菌（ streptomyces natalensis）、褐黄孢链霉菌（ streptomyces gilvosporeus）、恰塔努加链霉菌（ streptomyces chattanoogensis）等菌株发酵而产生的一种广谱抗真菌剂。因其低毒和极小改变食物本身味道可作为生物防腐剂。本实验通过在纳塔尔链霉菌 N5 菌株中添加真菌发酵液的方法 提高菌株纳他霉素
6、的产量。实验结果表明产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母三种菌的发酵液均对纳塔尔链霉菌 N5菌株的纳他霉素产量有明显的促进作用。 产黄青霉和黑曲霉培养 1d 时，其发酵液对 N5 菌株纳他霉素的合成促进效果最佳，而酿酒酵母在 3d 时促进效果最好，此时菌株纳他霉素产量较未加真菌发酵液处理样品高出约 1 倍。 关键词：纳塔尔链霉菌 N5 菌株 纳他霉素 产黄青霉 黑曲霉 酿酒酵母 目录 摘要 1 英文摘要 1 前言 1 1 实验材料及方法 2 1.1 实验材料 2 1.1.1 实验菌种 2 1.1.2 培养基 2 1.2 实验方法 2 1.2.1 纳塔尔链霉菌的培养 2 1.2.2 真菌发酵液的制备 2
7、1.2.3 纳他霉素产量的测定 2 1.2.4 真菌发酵液添加时间对纳他霉素产量的影响 2 1.2.5 真菌发酵时间对纳他霉素产量的影响 2 1.2.6 真菌发酵液添加量对纳他霉素产量的影响 3 2 结果与分析 3 2.1 纳他霉素标准曲线的制作 3 2.2 发酵液加入时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 3 2.2.1 产黄青霉发酵液加 入时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 3 2.2.2 黑曲霉发 酵液加入时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 4 2.2.3 酿酒酵母发 酵液加入时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 5 2.3 真菌培养时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 5 2.3.1
8、 产黄青霉培养时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 5 2.3.2 黑曲霉培养时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 6 2.3.3 酿酒酵母培养时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 6 2.4 真菌发酵液添加量对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 7 2.4.1 产黄青霉 发酵液添加量对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 7 2.4.2 黑曲霉 发酵液添加量对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 8 2.4.3 酿酒酵母 发酵液添加量对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 8 3 讨论与结论 9 参考文献 9 致谢 10 前言 1955 年 struyk 等人首次从南非 natal 州土壤中分离得到纳塔尔链霉菌（
9、 streptomyces natalensis），并发现该菌种可以产生一种内酯类抗生素， strnyk 将其命名为匹马菌素（ pimaricin） 1， 后世界卫生组织将其统一命名为纳他霉素。该抗生素是 一种二十六元多烯大环内酯类抗生素，主要由 纳塔尔链霉菌（ streptomyces natalensis）、褐黄孢链霉菌（ streptomyces gilvosporeus）、恰塔努加 链霉菌（ streptomyces chattanoogensis）等菌发酵产生2。 纳他霉素是一种高效、广谱的抗真菌剂，能有效抑制霉菌及酵母的生长，并能有效抑制丝状真菌中黄曲霉素的形成，可广泛应用于食品保
10、鲜及治疗真菌引起的疾病 3。 由于其分子上的疏水部分可以范德华力与细胞质膜上的甾醇分子结合，形成抗生素 甾醇复合物，破坏细胞质膜渗透性，引起菌体细胞内电解质渗出，因而可导致菌体死亡，起到抑菌作用 4。 纳他霉素在室温下溶解度仅为 30-100mg/L，微溶于甲醇，易溶于稀酸、冰醋酸和二甲基甲酰胺，不溶于 非极性溶剂 5。一般认为，由于纳他霉素难溶于水和油脂，所以很难被消化和吸收，因此人体摄入的纳他霉素大部分会随粪便排出 6。因为纳他霉素具有毒性低和不会对食品天然风味有较大改变的性质，美国食品及药物管理局 (FDA)和我国卫生部已经先后于 1982 年与 1997 正式批准纳他霉素作为食品添加剂
11、。迄今为止纳他霉素已经在食品工业中得到广泛应用 7。 由于各种因素的制约，国内纳他霉素的主要来源至今仍然是从国外进口。限制我国自主生产纳他霉素的主要问题是菌株产量偏低，导致纳他霉素的生产成本过高。这已成为急需解决的问题。 提高纳他霉素产量可以通过添加诱导子的方法。已有报道称一些微生物的发酵代谢物可产生某种诱导子调节其它微生物的次级代谢，促进其次级代谢产物的生成 8,9,10。本实验将产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母的发酵液分别添加入 纳塔尔链霉菌（ streptomyces natalensis）发酵液中，研究不同真菌发酵液对该菌株纳他霉素产量的影响，以期提高菌株纳他霉素产量。 1 实验 材料与方法
12、 1.1 实验材料 1.1.1 菌种 纳塔尔链霉菌 N5 菌株由中国科学院合肥物质科学研究院等离子所提供。 黑曲霉、产黄青霉、酿酒酵母由安徽农业 大学生命科学学院微生物学实验室保藏。 1.1.2 培养基 种子培养基 (g/L)：葡萄糖 20、酵母浸膏 5、蛋白胨 6、氯化钠 10， pH 7.2 发酵培养基 (g/L)：葡萄糖 10、酵母浸膏 5、大豆蛋白胨 20、淀粉 40， pH7.2 1.2 实验方法 1.2.1 纳塔尔链霉菌的培养 用接种环刮取斜面菌种一环于装有 25mL 种子培养基的 250mL 三角瓶中， 28、 200r/min 摇床培养， 40h 后以 9%接种量接种于装有 3
13、0mL 发酵培养基的 250mL 三角瓶中，28、 200r/min 摇床培养 4d。 1.2.2 真菌发酵液的制备 将产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母分别接种于装有 100mL 发酵培养基的 250mL 三角瓶中，28、 150r/min 摇床培养适当时间，用八层纱布过滤，再在 10000r/min 下离心 15min，取上清液进行微孔滤膜过滤即可得到无菌的真菌发酵液。 1.2.3 纳他霉素产量的测定 称取纳他霉素标准样品，溶于 5%冰乙酸的甲醇溶液中，使纳他霉素浓度分别为 1mg/L、2mg/L、 3mg/L、 4mg/L、 5mg/L、 6mg/L、 7mg/L、 8mg/L，用紫外分光光度计
14、测其在 303nm处的 OD 值，以纳他霉素浓度 为横坐标， OD303 值为纵坐标，绘制标准曲线。 取 N5 菌株发酵液 0.8mL 于 7.2mL 5%冰乙酸的甲醇溶液中。在震荡器上震荡 5min 后 10000r/min 离心15min。取上清液用紫外分光光度计测量 303nm 波长下的吸光度，根据标准曲线计算纳他霉素产量。 1.2.4 真菌发酵液添加时间对纳他霉素产量的影响 将产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母培养 3d 后分别以 5%接种量接种于纳塔尔链霉菌 N5 菌株发酵液中，接种时间分别为 0h、 12h、 24h、 36h、 48h、 60h、 72h，每个处理重复 3 次，并以不添加
15、真菌发酵液的处理为 对照。培养 4d 后测定菌株纳他霉素产量。确定真菌发酵液最适添加时间。 1.2.5 真菌发酵时间对纳他霉素产量的影响 分别在产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母培养 1d、 2d、 3d 时取样，制备无菌发酵液。将培养不同时间的真菌发酵液以 5%接种量加入培养 12h 的纳塔尔链霉菌 N5 菌株发酵培养液中，每个处理重复 3 次，并以不添加真菌发酵液的处理为对照。继续培养 84h 后测定菌株纳他霉素产量。确定 3 种真菌的最佳发酵时间。 1.2.6 真菌发酵液添加量对纳他霉素产量的影响 将产黄青霉、黑曲霉培养 1d， 酿酒酵母培养 3d，制备 无菌发酵液， 并分别以 1% 、 2%
16、、5% 、 8% 、 10% 、 15% 、 20%的添加量加入到培养 12h 的纳塔尔链霉菌 N5 菌株发酵培养液中，每个处理重复 3 次并以不添加真菌发酵液的处理为对照。培继续培养 84h 后测定菌株纳他霉素产量。确定 3 种真菌的最佳发酵时间。 2结果及分析 2.1 纳他霉素标准曲线的制作 以纳他霉素浓度为横坐标， OD303 值为纵坐标绘制纳他霉素标准曲线，见图 1。由图 1可看出纳他霉素浓度与 OD303 值呈线性相关，且 R2=0.9988 线性较好。因此可通过此标准曲线方程 x=（ y 0.0065)/0.1489 计 算纳他霉素产量。 y = 0.1 489 x + 0.0 0
17、65R2= 0.9 98800.10.20.30.40.50.60.70.80.910 1 2 3 4 5 6 7纳他霉素浓度（ m g / L ）OD303值图 1 纳他霉素标准溶液曲线 Fig1 The standard curve of natamyctn 2.2 发酵液加入时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 2.2.1 产黄青霉发酵液加入时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 将产黄青霉发酵培养基进行适当处理后接种于培养不同时间的纳塔尔链霉菌 N5菌株发酵液中，继续培养，当菌株培养 4d 时用紫外分光光度法测定纳他霉素产量，结果如图 2 所示。由图 2 可看出产黄青霉发酵液对 N5 菌
18、株纳他霉素产量有明显的促进作用 ，当在发酵培养 12h 时添加效果最佳，此时菌株纳他 霉素产量达 1.42g/L，较对照提高 65.96。 00.20.40.60.811.21.41.6CK 0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h纳他霉素产量（gL-1）图 2 产黄青霉发酵液添加时间对纳他霉素产量的影响 Fig 2 Effects of addition time of fermentation broth of Penicillium chrysogenum on the natamycin production of N5 strain 2.2.2 黑曲霉发 酵液加入时间对
19、N5 菌株纳他霉素产量的影响 将培养 3d 的黑曲霉发酵培养液适当处理后于不同时间添加入 N5 菌株发酵培养 液中，继续培养，当菌株培养 4d 时测定纳他霉素产量，结果见图 3。从图 3 中可以看出黑曲霉发酵液对 N5 菌株纳他霉素产量的提高有显著的促进作用 。当在发酵培养 12h 时添加效果最佳，此时菌株纳他霉素产量达 1.44g/L，较对照提高 67.44。 00.20.40.60.811.21.41.6CK 0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h纳他霉素产量（gL-1）图 3 黑曲霉发酵液添加时间对纳他霉素产量的影响 Fig 3 Effects of addition ti
20、me of fermentation broth of Aspergillus Niger on the natamycin production of N5 strain 2.2.3 酿酒酵母发 酵液加入时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 酿酒酵母发 酵液加入时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响见图 4。由图可见，酿酒酵母发酵液也可明显促进 N5 菌株纳他霉素的合成，最适接入时间也是菌株培养的 12h。 00.20.40.60.811.21.41.6CK 0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h纳他霉素产量（gL-1）图 4 酿酒酵母发酵液添加时间对纳他霉素产量的影响 Fig
21、4 Effects of addition time of fermentation broth of Saccharomyces cerevisiae on the natamycin production of N5 strain 2.3 真菌培养时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 2.3.1 产黄青霉培养时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 将分别培养 1d、 2d、 3d 的 产黄青霉发酵液进行适当处理，添加至培养 12h 的 N5 菌株发酵培养液中，继续培养 84h 后测定菌株纳他霉素产量，结果如图 5 所示。由图 5 可以看出培养 1d 的产黄青霉发酵液对 N5 菌株纳他霉素产量
22、的促进作用最显著。随着产黄青霉培养时间的延长，发酵液对 N5 纳他霉素产量的促进作用呈下降趋势。因此，产黄青霉的最佳培养时间为 1d。 图 5 产黄青霉培养时 间对纳他霉素产量的影响 Fig 5 Effects of culture time of Penicillium chrysogenum on the natamycin production of N5 strain 2.3.2 黑曲霉培养时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 将培养不同时间的 黑曲霉发酵液添加入 N5 菌株发酵液中，培养后测定纳他霉素产量，结果见图 6。由图 6 可以看出当在 N5 菌株发酵液中添加培养 1d 的黑曲
23、霉发酵液时，纳他霉素产量最高，因此，黑曲霉的最佳培养时间确定为 1d。 图 6 黑曲霉培养时 间对纳他霉素产量的影响 Fig 6 Effects of culture time of Aspergillus Niger on the natamycin production of N5 strain 2.3.3 酿酒酵母培养时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 酿酒酵母培养时间对 N5 菌株纳他霉素产量的影响如图 7 所示。由图 7 可见，当在 N5菌株发酵液中添加培养 3d 的酿酒酵母发酵液时，纳他霉素产量最高，因此，酿酒酵母的最佳培养时间确定为 3d。 图 7 酿酒酵母培养时间对纳他霉素产
24、量的影响 Fig 7 Effects of culture time of Saccharomyces cerevisiae on the natamycin production of N5 strain 2.4 真菌 发酵液添加量对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 2.4.1 产黄青霉 发酵液添加量对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 将培养 1d 的产黄青霉发酵液处理后以不同添加量添加于培养 12h 的纳塔尔链霉菌 N5菌株发酵培养液中， 于 28、 200r/min 条件下继续培养 84h，测定纳他霉素产量。以产黄青霉发酵液添加量为横坐标，纳他霉素产量为纵坐标做图， 见图 8。从图 8 中可
25、以添加 5的产黄青霉发酵液对 N5 菌株纳他霉素的积累效果最显著，此时纳他霉素产量达 1.69g/L，较对照提高 94.25%。 00.20.40.60.811.21.41.61.8CK 1% 2% 5% 8% 10% 15% 20%纳他霉素产量（gL-1）图 8 产黄青霉发酵液添加量对纳他霉素产量的影响的影响 Fig 8 Effects of addition amount of Penicillium chrysogenum fermentation broth on the natamycin production of N5 strain 2.4.2 黑曲霉 发酵液添加量对 N5 菌株
26、纳他霉素产量的影响 将培养 1d的黑 曲霉发酵液处理后以不同添加量添加于培养 12h的纳塔尔链霉菌 N5菌株发酵培养液中， 于 28、 200r/min 条件下继续培养 84h，测定纳他霉素产量结果如图 8 所示。由图可看出 5的黑曲霉发酵液对 N5 菌株纳他霉素的积累效果最佳，因此，黑曲霉发酵液的最适添加量确定为 5。 00.20.40.60.811.21.41.61.8CK 1% 2% 5% 8% 10% 15% 20%纳他霉素产量（gL-1）图 9 黑曲霉发酵液添加量对纳他霉素产量的影响的影响 Fig 9 Effects of addition amount of Aspergillus
27、 Niger fermentation broth on the natamycin production of N5 strain 2.4.3 酿酒酵母 发酵液添加量对 N5 菌株纳他霉素产量的影响 酿酒酵母 发酵液添加量对 N5 菌株纳他霉素产量的影响见图 10。 从图 10 中可以看出 5的酿酒酵母发酵液对 N5 菌株纳他霉素的积累效果最佳，因此，黑曲霉发酵液的最适添加量确定为 5。 00.20.40.60.811.21.41.61.8CK 1% 2% 5% 8% 10% 15% 20%纳他霉素产量（gL-1）图 10 酿酒酵母发酵液添加量对纳他霉素产量的影响的影响 Fig 10 Effects of addition amount of Saccharomyces cerevisiae fermentation broth on the natamycin production of N5 strain
