1、实验九 纳他霉素的发酵生产、分离纯化及检测 1一. 实验目的：通过摇瓶发酵生产纳他霉素，加深对好氧发酵过程中菌体生长与次级代谢产物积累的关系的认识，积累代谢调控发酵及相关产品分离纯化和分析检测的经验。二. 实验原理：纳他霉素（Natamycin）是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，也称游链霉素或匹马霉素(Pimaricin)。它是由 5 个多聚乙酰合成酶基因编码的多酶体系合成。由于它能够专性地抑制酵母菌和霉菌，被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗。1. 纳他霉素的结构和性质图 8-1 纳他霉素的分子结构1 此实验为综合性设计性实验，需至少 24 学时。以下时间安排供参考。第一周：老师做好斜面；
2、学生领取并清洗仪器，接种斜面制备孢子，配制种子培养基。第二周：学生在显微镜下观察孢子的形状；将斜面孢子接种到种子培养基中摇瓶培养；配制发酵培养基。24hr 后在显微镜下观察检查种子培养物的形态，将培养 1 天的种子接种到发酵培养基中摇瓶培养；做标准曲线。第三周：在显微镜下观察培养物的形态，测定发酵 48 小时后的纳他霉素含量、还原糖含量、氨氮含量。并每隔 24hr 在显微镜下观察培养物的形态，测定相应发酵时间后的纳他霉素含量、还原糖含量、氨氮含量。直到发酵 196 小时为止。第四周：合并所有发酵液，提取纯化纳他霉素。第五周：按正式发表的科技论文格式完成实验报告。纳他霉素是近白色至奶油黄色结晶粉
3、末，几乎无臭无味，溶点 280（分解），分子式 C33H47O13，相对分子量 665.75，结构式如图所示。纳他霉素是一类两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为 6.5。纳他霉素在水中和极性有机溶剂中溶解度很低，不溶于非极性溶剂，室温下在水中的溶解度为 3050mg/L。易于溶于碱性和酸性的水溶液中。转变为胆酸盐形式后溶解度可以迅速增加。纳他霉素的低水溶性不利于它的生物利用度。因为溶解的纳他霉素必须扩散到目标物的活性部位，并且和目标物结合才能发挥作用。在大多数食品的 pH 值范围内，纳他霉素是非常稳定的。高温、紫外线、氧化剂及重金属等会影响纳他霉素低的稳定性。但可以瞬时高温（
4、温度可达100）不影响其活性。N-Natamycin(3-N-dimethylaminopropylsuccimido)的活性比较低，可能是对它的化学修饰都会降低其活性，纳他霉素是经深层发酵和多步提取工艺精制而成，其制剂通常是 50%纳他霉素和 50%乳糖的混合物。纳他霉素的生产菌种主要有 Streptomyces chattanovgensis, Streptomyces natulonso, Streptomyces gilvosporeus 等 3 种链霉菌。本实验所用菌种为褐黄孢链霉菌（ Streptomyces gilvosporeus），孢子丝螺旋形。孢子表面带刺。在发酵过程中，培
5、养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源(葡萄糖)。纳他霉素在以葡萄糖作为碳源时产量最高，这是因为葡萄糖能渗入纳他霉素的分子中去。有资料表明，氮源的类型对菌体生长和纳他霉素的产量有较大影响，菌体细胞生长最好的氮源是酵母抽提物，而纳他霉素产生的最佳氮源是牛肉浸出物。2. 纳他霉素的抑菌作用机制纳他霉素是 26 种多烯烃大环内酯类抗真菌剂的一种，多烯是一平面大环内酯环状结构，纳他霉素分子的疏水部分即大环内酯的双键部分以范德华力和真菌细胞质膜上的甾醇分子结合，形成抗生素甾醇复合物，破坏细胞质膜的渗透性；
6、分子的亲水部分即大环内酯的多醇部分则在膜上形成水孔，损伤膜的通透性，从而引起菌内氨基酸、电解质等重要物质渗出而死亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些类甾醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有作用。三. 药品及仪器设备1. 药品酵母提取粉、麦芽提取粉、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、氯化钠、大豆分离蛋白、麦芽糊精、酵母提取粉、乙醇、甲醇、20NaOH、抗氧化剂 BHA、1，2 丙二醇、纳他霉素标准品2. 仪器设备250ml 三角瓶、摇床、生化培养箱、离心机、紫外分光光度计四. 操作步骤1. 孢子、种子液的制备和摇瓶发酵(1) 菌种：褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）
7、(2) 斜面孢子培养 孢子培养基酵母提取粉 4g/L麦芽提取粉 10 g/L葡萄糖 4g/L琼脂 20g/LpH7.0 孢子斜面制备按斜面孢子培养基配方称好原料，用融化琼脂溶解，定容，用 20氢氧化钾调 pH，121灭菌 15 分钟，摆斜面冷却后置于 37培养 12 天，备用。用斜面转管接种，25培养 10 天，待孢子长满后，放置冰箱 5 天以上再用。涂片观察孢子形态，并显微拍照。(3) 摇瓶种子培养 摇瓶种子培养基共 100ml，分装 2 瓶葡萄糖 15g/L蛋白胨 10g/L氯化钠 10g/LpH7.0 摇瓶种子制备按摇瓶种子培养基配方称好原料，用水溶解，定容，调 pH，分装（250ml装
8、 50ml），121灭菌 15 分钟。待培养基冷却后，刮取孢子接种摇瓶，每支斜面接种 5 瓶摇瓶。，29，200rpm 振荡培养 24 小时。无菌取样，涂片观察种子菌球形态，并显微拍照。(4) 摇瓶发酵培养 摇瓶发酵培养基 1000ml，分装 6 瓶大豆分离蛋白 19.5g/L麦芽糊精 50g/L酵母提取粉 4g/L葡萄糖 6g/LpH7.0 摇瓶发酵按摇瓶发酵培养基配方称好原料，用水溶解，定容，调 pH，分装（250mL装 40mL），121灭菌 25 分钟。待培养基冷却后，取摇瓶种子 1ml 接种，29，200rpm 振荡培养 120168hr。每隔 24hr 无菌取样，涂片观察菌球形态，
9、并显微拍照。染色方法：取一滴样品，小心打散后，加一滴染料，静置 30 秒染色。酒精灯（离火焰稍远点）固定 20 秒，细流水冲洗掉染料，盖上盖玻片，用吸水纸吸干多余水分，分别在低倍镜、高倍镜和油镜（如果需要）下观察孢子、种子和菌丝球形态。2. 纳他霉素的提取与检测纳他霉素不溶于水，因此它在发酵液中呈晶体状。纳他霉素晶体有针型的，圆盘型的等等。它们都是在发酵过程中形成，直径一般在 0.520nm。从接种后第 48hr 开始，每隔 24hr 从每瓶发酵液中取 0.5mL 的发酵液，混合均匀，取混合后的发酵液 0.5mL，加 4.5mL 的丙二醇（此过程样品稀释了 10倍9），在摇床上震荡 1 小时，
10、12000rpm 离心 10min，取 0.5mL 上清液，加4.5ml 蒸馏水（此过程样品再次稀释了 10 倍），摇匀，在紫外分光光度计303nm 测定光密度。如果吸光度太大，需要再稀释一次，计算结果时记得乘以此稀释倍数。剩余的混合后的发酵液平批分成 2 份，分别用于测定还原糖和氨氮。标准曲线：取 50mg 的纳他霉素，溶于 100mL 丙二醇，得浓度为 500g/mL的纳他霉素原液。按表 8-1 制作曲线，横坐标为纳他霉素工作溶液浓度，纵坐标为 OD303nm。注意给出回归方程（y=kx+b）和相关系数（R 2），如果相关系数0.98，要求重做标准曲线。产物浓度计算公式为：纳他霉素含量（m
11、g/L）=X100n其中：X 为将所测样品的 OD303nm作为 y 值，代入回归方程中求出的相应的x 值。100 为样品处理时 2 次稀释倍数之积。如果所得样品 OD303nm超出标准曲线范围为，则稀释 n 倍后再次测定。表 8-1 纳他霉素标准曲线工作表管号 1 2 3 4 5 6工作溶液浓度（g/mL） 2 0 2.5 5 7.5 10 12.5纳他霉素原液（mL）添加量0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25水（mL） 10 9.95 9.9 9.85 9.8 9.75OD303 CK3. 纳他霉素的分离纯化 3(1) 发酵液 6000rpm 离心 10min。离心前发酵液的体
12、积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积。(2) 湿菌泥加 2 倍体积 95%乙醇，20%氢氧化钠调 pH1010.5，边加边搅拌0.5hr（注意一定要调过 pH 后再计时），以便纳他霉素充分溶解。(3) 6000rpm 离心 10min，保留上清液。(4) 用 1N 盐酸调 pH6.5，静置 3hr 以上（或冰箱过夜），以便纳他霉素在等电点处沉淀析出。2 此行为自动生成数据，不需学生计算。3 如果使用低速大容量离心机，转速可能达不到要求，可适当延长离心时间。(5) 6000rpm 离心 10min，保留沉淀（产物）。(6) 55真空干燥 2hr，称重。五. 结果及分析讨论表 8-2 实验结
13、果发酵时间（h）菌球形态 还原糖含量（g/L）氨氮含量（g/L）纳他霉素浓度（g/L）487296120144168六. 实验报告1. 按正式发表的科技论文格式撰写成小论文（老师可提供格式范本）。2. 同组同学可以共享实验数据，但不允许相互抄袭。对同一实验现象或实验结果可以有不同的理解和分析。3. 写出实验心得体会，比如自己对实验结果是否满意，学会了什么，还有哪些做的不够。七. 思考题：4. 种子液菌球与发酵液菌球在形态上有什么区别？为什么会有这种区别？5. 纳他霉素的分离纯化中需要两次调节 pH 值，其目的和作用分别是什么？ 6. 各时期取样观察到的菌丝形态、还原糖含量、氨基氮含量和产物产量
14、之间有什么关联性？日程安排 11 生工（2） 日程安排 11 生工（1）第 8 周周一老师做好斜面；学生领取并清洗仪器，接种斜面制备孢子，配制种子培养基。配制发酵培养基。灭菌枪头第 8 周周五老师做好斜面；学生领取并清洗仪器，接种斜面制备孢子，配制种子培养基。配制发酵培养基。灭菌枪头第 9 周周一学生在显微镜下观察孢子的形状；将斜面孢子接种到种子培养基中摇瓶培养； 第 9 周周五学生在显微镜下观察孢子的形状；将斜面孢子接种到种子培养基中摇瓶培养；配制发酵培养基。周二种子培养 24hr 后：在显微镜下观察检查种子培养物的形态，将培养 1 天的种子接种到发酵培养基中摇瓶培养；做标准曲线。周六种子培
15、养 24hr 后：在显微镜下观察检查种子培养物的形态，将培养 1 天的种子接种到发酵培养基中摇瓶培养；做标准曲线。周四无菌操作取样，在显微镜下观察培养物的形态，测定发酵 48小时后的纳他霉素含量第 10 周周一无菌操作取样，在显微镜下观察培养物的形态，测定发酵 48 小时后的纳他霉素含量第 10周本周五至下周每隔 24hr 无菌操作取样，在显微镜下观察培养物的形态，测定相应发酵时间后的纳他霉素含量、还原糖含量、氨氮含量。直到发酵 168 小时为止。最后一次测定产物后合并所有周二至周六每隔 24hr 无菌操作取样，在显微镜下观察培养物的形态，测定相应发酵时间后的纳他霉素含量、还原糖含量、氨氮含量
16、。直到发酵 168 小时为止。最后一次测定产物后二 发酵液，12000rpm 离心10min。离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积。湿菌泥加 2倍体积 95%乙醇，20%氢氧化钠调 pH1010.5，边加边搅拌0.5hr（注意一定要调过 pH 后再计时），置于冰箱中以便纳他霉素充分溶解。合并所有发酵液，12000rpm离心 10min。离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积。湿菌泥加 2 倍体积 95%乙醇，20%氢氧化钠调pH1010.5，边加边搅拌0.5hr（注意一定要调过 pH后再计时），置于冰箱中以便纳他霉素充分溶解。第 11周周一12000rpm 离心 10min，保留上清液。用 1N 盐酸调 pH6.5，静置 3hr 以上（冰箱） ，以便纳他霉素在等电点处沉淀析出。第 11 周周五12000rpm 离心 10min，保留上清液。用 1N 盐酸调pH6.5，静置 3hr 以上（冰箱），以便纳他霉素在等电点处沉淀析出。第 12周周一12000rpm 离心 10min，保留沉淀（产物） 。55真空干燥2hr，称重。按正式发表的科技论文格式完成实验报告。第 12 周周五12000rpm 离心 10min，保留沉淀（产物） 。55真空干燥2hr，称重。按正式发表的科技论文格式完成实验报告。
