奶粉中蛋白质含量的方法[1].doc

1、 【摘要】 目的 尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法 使用三氯乙酸沉淀蛋白质后，运用 BCA（二喹啉甲酸）法，在 570 nm 波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。结果 待测溶液中蛋白质浓度在 0 250 g/ml 范围内标准曲线呈线性关系，其回归方程为： Y=301.12X-73.42，相关系数 r=0.998，平均回收率为 100.2%。结论 结合三氯乙酸沉淀的 BCA 法适用于奶粉中蛋白质的快速检验和掺伪 检验。 【关键词】 奶粉；蛋白质； BCA 法；三氯乙酸；三聚氰胺 A

2、rapid and simple method of protein determination in powdered milk Zhang Zhiqiao, Shen Guodong, Wang Gang First Middle School of Hefei, Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University, Hefei 230001 Abstract Objective To explore a rapid and simple method of protein determination in po

3、wdered milk without other nitrogen-containing compound disturbance in Kjeldahl determination.Methods Conjugated with protein precipitation with trichloroacetic acid, BCA (bicinchoninic acid) method was used. According to the positive relationship of protein content with the 570 nm absorbance, protei

4、n content was calculated in powdered milk.Results Protein content in milk solution showed a good linear relationship at the detection ranges of 0-250 g/ml, with regression equation: Y=301.12X-73.42 and related coefficient: 0.998, and the average recovery rate was 100.2%.Conclusion BCA method conjuga

5、ted with trichloroacetic acid is adaptable to the rapid and sensitive determination of protein in powdered milk. Key words Powdered milk; Protein; BCA method; Trichloroacetic acid; Melamine 蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质定量方法较多 , 如凯氏定氮法、紫外分光光度法和 Lowry 法等。虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费

6、时，且蛋白质含量是通过测定 氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如 2008 年 9 月 “问题奶粉 ”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）； Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点 1。为弥补这些不足，本实验利用 BCA（二喹啉甲酸）法结合三氯乙酸沉淀法建立一种快速简便的测定奶粉中蛋白质含量的方法。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 1.1.1 仪器 酶标仪（型号 ELX800， BIO-TEK INSTRUMENTS 公司）， 96 孔 微孔板，化学分析滤纸（直径： 9 cm，最大孔径： 10 m，杭州新华

7、纸业有限公司），玻璃漏斗、烧杯等。 1.1.2 试剂 光明全脂速溶奶粉（黑龙江省光明松鹤乳品有限责任公司，产地：齐齐哈尔，生产日期：20081010），蒙牛学生多维高钙高锌奶粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，产地：呼和浩特，生产日期： 20081207），尿素（分析纯，上海苏懿化学试剂有限公司），三聚氰胺（化学纯，上海凌峰化学试剂有限公司），硝酸铵（分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司），三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司） ， BSA（牛血清清蛋白，美国 Sigma 公司） BCA 试剂盒（ PIERCE 公司， BCA23225），去离子水。 1.2 实验方法 1.2.1 方法原理

8、据资料介绍， BCA 法是目前已知的一种敏感准确的蛋白质测试法，广泛用于国内外企业和科研院所进行蛋白质含量检测。其主要原理是：要分析的蛋白质在碱性溶液里与 Cu2+ 反应产生 Cu+ ， Cu+与 BCA 形成一种紫色化合物，其吸收峰在 562 nm 波长处。 BCA 法定量分析蛋白质具有准确灵敏（ 20 2 000 g/ml）、快速（约 40 min）、稳定和经济 实用（可以用试管或微孔板测定），以及它是反应物与蛋白质直接作用，对铵盐类等含氮化合物的抗干扰能力较强等特点。 三氯乙酸沉淀蛋白质的主要原理：三氯乙酸作为蛋白质变性剂可使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水基团，使之聚集沉淀。据文献

9、报道，三氯乙酸比硫酸铜等物质能更好地排除非蛋白氮对溶液中蛋白氮的影响，具有广泛的适用性。 1.2.2 标准应用曲线的绘制 配制 2 mg/ml 牛血清清蛋白（ BSA）溶液作为标准蛋白质储存液（含有 9 g/L 氯化钠），参照 BCA 试剂盒说明书所示方法，按表 1 所示配 制不同浓度 BSA 工作液，用定性滤纸过滤，收集滤液并记录体积，取其中 200 l滤液加入等体积的 10%三氯乙酸溶液，充分反应后 12 000 r/min 离心 30 min，吸取上清液待测；以 9 g/L 氯化钠溶液为空白对照，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各 25 l加入微孔板上相应的各个微孔中，每孔还加入2

10、00 l A液与 B 液（ 10A 1B）的混合工作液， 60 水浴 30 min，用酶标仪在 570 nm 波长下测定各个微孔中溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白质质量浓度为横坐标，计算标准回归方程并绘制工作曲 线。表 1 不同浓度 BSA 工作液的配方（略） 1.2.3 样品制备与测定 准确称量牛奶粉 150 mg/份和 300 mg/份各 4 份，分别倒入贴有 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、8 标签的 8 个 50 ml 离心管中，再分别称量 20 mg 的硝酸铵、三聚氰胺和尿素各 2 份，按表 2 示倒入对应的离心管中。加入适量 60 9 g/L 氯化钠溶液充分溶解，并用

11、100 ml 容量瓶定容至刻度。用定性滤纸过滤，收集滤液并记录体积，取其中 200 l滤液加入等体积的 10%三氯乙酸溶液，充分反应后 12 000 r/min 离心 30 min，吸取上清液待测；以 9 g/L 氯化钠溶液为空白对照，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各 25 l加入微孔板上相应的各个微孔中，每孔还加入 200 l AB（ 10A 1B）混合液， 60 水浴 30 min，用酶标仪在 570 nm 波长下测定各个微孔中溶液的吸光度，从标准工作曲线上查出对应的蛋白质浓度。表 2 待测样品组成（略） 1.2.4 分析结果的表述与计算 样品中蛋白质的含量 X 按式 (1)计算：

12、 X=10CF (1)，式中： X-样品中蛋白质的含量， g/100 ml(g)， C-测定样品溶液 中蛋白质含量（ mg/ml）， F-稀释倍数。 1.2.5 允许差 同一样品的两次测定结果之差，不得超过平均值的 51%。 2 结果 2.1 标准工作曲线及线性范围 以 BSA 各级工作液的蛋白质浓度（ Y， gmoL-1）对其 OD 值（ X）作图，结果表明蛋白质浓度在 0 250 g/ml范围内标准工作曲线呈线性关系，标准曲线方程：Y=301.12X-73.42，相关系数 r=0.998。见附图。 附图 蛋白质含量测定的标准曲线 2.2 样品测定中干扰因素的影响 取上述添加了不同干扰物质的

13、 样品，按上述实验方法进行操作，结果发现，在 60 的水中三聚氰胺等添加物质都能充分溶解，只是过滤速度表现不一样：添加了三聚氰胺的奶粉溶液过滤速度最快（ 3 号和 7 号管分别用时为 19 min 和 21 min），添加了尿素的奶粉溶液次之（ 4 号和 8 号管分别用时为 79 min 和 92 min），添加了硝酸铵的奶粉溶液最慢（ 2 号和 6 号管分别用时为 112 min和 124 min）。 分别收集滤液和三氯乙酸沉淀后的上清液进行 BCA 法检测蛋白质含量，测得各项实验数据如表 3。结果发现三种不同的非蛋白质的含氮化合物基本不影 响蛋白质含量的正确测定：质量 150 mg 的奶粉

14、添加三种含氮化合物后平均蛋白质含量为 35.72 mg，标准方差为1.38 mg；质量 300 mg 的奶粉添加三种含氮化合物后平均蛋白质含量为 62.13 mg，标准方差为 1.43 mg；分别与空白对照的 34.96 mg 和 65.56 mg，以及厂家奶粉中蛋白质标示量36 mg 和 72 mg 相比，二者差异都不明显。同时实验结果也表明本实验所用奶粉的蛋白质含量达到国家要求（我国食品营养标签管理规范的技术附件中规定，对于蛋白质和碳水化合物，其允许的误差范围是 80%标示值 ）。表 3 不同样品蛋白质含量测定（略） 2.3 方法的加标回收率 分别取奶粉 1（光明全脂速溶奶粉，其稀释液为稀

15、释液 1）和奶粉 2（蒙牛学生多维高钙高锌奶粉，其稀释液为稀释液 2）加入 60 9 g/L 氯化钠溶液进行 1/1 000 样品稀释，做方法加标回收试验，结果见表 4，该方法的平均加标回收率为 100.2%。 表 4 方法的加标回收率 3 讨论 奶粉中蛋白质含量是奶粉检验工作的一项重要指标。目前国内主要采用常规凯氏定氮法， 国外也多采用常规或改良的凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量，但此 法费时、费水、费电，操作繁琐， 试剂消耗量大，且不能有效区分非蛋白氮 2、 3。常见的含氮化合物如硝酸铵和尿素比牛奶蛋白质的含氮率都高，易溶于水，很容易掺入奶粉等食物中；而三聚氰胺虽然常温和冷水状况下在水中的溶

16、解度非常低 4，但是人们平时习惯上和奶粉说明书上都要求用温开水冲调，例如 60 时三聚氰胺在 100 g 水中可以溶解 1.8 g， 100 时溶解 6.4 g，因而掺伪问题容易受到人们的忽视。 国内已有多篇文献涉及有关乳制品中蛋白质含量测定方法的研究，例如，云南工业大学张惠芬等探讨了在奶粉、豆奶粉、鱼 粉中人为掺入尿素、硫酸铵等含氮化合物对蛋白质测定的影响，结果表明：用 95%乙醇能很好地将尿素与食品中蛋白进行分离，回收率较高，并能方便、快速测定掺入量。对掺入硫酸铵等无机铵盐的测定，采用加 MgO 调到弱碱性，直接蒸馏测定 5。成都理工大学李海玲等通过对 Lowry法、 BCA 法、磺基水杨

17、酸沉淀法、Bradford 法等 4 种常用蛋白浓度测定方法的研究认为，确定 PEG-IL-6 的最佳蛋白浓度测定方法为 BCA 法，而包涵体变性液中的蛋白浓度只能用 Bradford 法测定 6。中国农业大学食品科学与营养工程学院牛巍等利用三 氯乙酸沉淀蛋白法和硫酸铜沉淀蛋白法对添加了非蛋白氮的液态奶进行蛋白氮测定。结果表明，三氯乙酸沉淀法能更有效地排除非蛋白氮对液态奶蛋白氮测定的影响 7。河北省衡水市疾病预防控制中心田志梅等分别运用紫外分光光度法及甲醛值滴定法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量。结果显示，两种方法均可有效解决非蛋白质类含氮物质对牛奶中蛋白质测定结果的干扰问题 8,9。中国农业

18、大学侯彩云等使用三氯乙酸使蛋白质沉淀后，不同含量的蛋白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不同的蓝紫色的络合物，根据其色度值与蛋白氮含量高低呈线性相关关系， 用计算机软件自动分析获得的样品色度值，从而计算出蛋白氮含量 10。 综上所述，目前国内用于测定奶粉中蛋白质含量的方法有多种，其测定原理及结果的准确性各不相同，每种方法都有其优点及局限性。相比较而言，本项目运用 BCA 法结合三氯乙酸沉淀蛋白法检测奶粉中蛋白质的含量，可以有效排除三聚氰胺等非蛋白氮的干扰，具有简便、快速、准确、实用的特点，可作为检测机构和平时人们准确检测蛋白质含量时考虑运用的方法之一。 奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、

19、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品之一。因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。 摘要 ： 牛奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品之一。因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。 关键字： 牛奶 蛋白质 钙 铁 锌 1、实验目的 用分光光度法测某牛奶中 蛋白质、钙、铁、锌的含量。 2、实验原理 牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为

20、 4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的 pH 调至 4.7 时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 双缩脲 (NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与 Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质 浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除 -CONH-有此反应外， -CONH2、 -CH2NH2、 -CS-NH2等基团也有此

21、反应。 钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。补钙越来越被人们所重视。牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛 奶产品中还特地加钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙的含量，可采用 EDTA法进行直接测定。考虑到牛奶中含有 Fe3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节 pH12 13，以铬蓝黑 R 作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用 EDTA 滴定至计量点时，游离出指示剂，溶

22、液呈现蓝色。 当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。 吸光度用 A 表示。 A abc，其中 a 为吸光系数，单位 L/(gcm),b 为液层厚度（ 通常为比色皿的厚度），单位 cm ， c 为溶液浓度，单位 g/L 影响吸光度的因数是 b 和 c。 a 是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响 c，而影响 A。 符号 A，表示物质对光的吸收程度。 邻二氮菲也叫邻菲啰啉，是测定微量 Fe2+的高灵敏度显色剂 在 pH 2 9 的条件下， Fe2+与邻二氮菲生成稳定的橙红色络合物，在 510nm波长处有最大吸收。 测

23、定时，控制溶液的酸度在 pH 5 左右较为适宜。酸度高时，反应进行较慢；酸度太低，则 Fe2+离子水解，影响显色。 当铁浓度在 5.0 mg mL 以内时，吸光度与 Fe2+浓度呈直线关系。 Bi3+、 Cd3+、 Hg9+、 Ag+、 Zn2+等离子在 pH 29 时与邻二氮菲生成沉淀。 Co2+， Ni2+， Cu2+等离子可与邻二氮菲形成有色配合物，故应注意它们的干扰。 锌是人体中必需的微量元素之一，锌缺乏会阻碍生长发 育，过量又会导致胃癌等疾病。人类从牛奶等饮食中可以获得一定量的锌。在 pH4.0 5.5 的水溶液中，锌离子与双硫腙（ C13H12N4S）生成红色螯合物，摩尔吸光系数

24、535 =9.3104Lmol-1cm-1用四氯化碳萃取后比色定量。在选定的 pH条件下，用 足够量的硫代硫酸钠可掩蔽水中存在的少量铅、铜、镉、钴、铋、镍、金、钯、银、亚锡等干扰金属离子。 3、实验步骤 3.1、试剂的配制 3.11、 pH4.7 醋酸 -醋酸钠缓冲液的配制 : 先配 A 液与 B 液。 A 液： 0.2mol/L 醋酸钠溶液。 B 液： 0.2mol/L 醋酸溶 液。 取醋酸钠固体 6.5461g 加水溶解并稀释至 100ml，取冰醋酸 5mL 加水稀释至 100ml，混合即得 pH4.7 的醋酸 醋酸钠缓冲液 200mL。 3.12、乙醇 乙醚混合液的配制：取 25ml95

25、乙醇与 25ml 无水乙醚混合 3.13、双缩脲试剂：称取 CuS045H2O 0.3g，酒石酸钾 0.9 g 和碘化钾 0.5g，分别溶解后混匀，加 6 molL-1NaOH 10mL，最后加水至 100mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。 3.14、蛋白质标准液 (10mgmL-1)，用小烧杯称取干燥的牛血清 蛋白 100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入 l0mL 容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。（如若不能溶解，滴加几滴6mo

26、l/L NaOH 溶液、分别用 l0mL 容量瓶定容） 3.15、 铁标准溶液 (40.0gmL-1)： :准确称取 0.0345g 硫酸铁铵 NH4 Fe (SO4)212H2O于烧杯加入 6mL6 molL-1 HCl 和少量水，溶解后 用纯水定容至 10mL。此溶液 1.00mL 含有 40.0g 铁。 3.16、盐酸羟胺溶液 (100 gL-1)： :称取 10g 盐酸羟胺 (NH2OHHCl)，溶于水，并稀释至 100m（新鲜配制，两周内有效） 3.17、邻二氮菲溶液 (2gL-1):：称取 0.20g 邻二氮菲 (C12H8N2H 2O)，溶解于加有 2 滴浓盐酸的纯水，并稀释至

27、100mL（新鲜配制，两周内有效） 3.18、醋酸钠溶液（ 1.0 molL-1）： :称取 8.2030g 醋酸钠，用纯水溶解后稀释至 100mL。 3.19、锌标准溶液（ 1.00g mL-1）：准确称取 0.0100g 基准锌于 100mL 烧杯中，加入 6 molL-1HCl 0.5mL，立即盖上表面皿，待锌完全溶解后，以少量水冲洗表面皿及烧杯壁，将溶液转入 100mL 容量瓶中，定容，即为锌标准贮备溶液。准确移取 1mL 锌标准贮备溶液，稀释定容至 100.0mL，即得 1.00g mL-1锌标准溶液。 3.20、 0.1双硫酸腙四氯化碳贮备溶液：称取 0.10g 双硫腙（ C18H

28、12N4S），在干燥的烧杯中用四氯化碳溶解后稀释至 100 mL， 倒入棕色瓶中。此溶液置冰箱内保存，可稳定数周。 3.21、双硫腙四氯化碳溶液：临用前，吸取适量双硫腙四氯化碳贮备溶液，用四氯化碳稀释约 30 倍，至吸光度为 0.4（波长 535 nm， 1cm 比色皿）。 3.22、 25硫代硫酸钠溶液：称取 64.60g 硫代硫酸钠（ Na2S2035H20)，溶于 100mL 纯水中。 3.23、 1 1 氨水溶液 :10ml 氨水加 10ml 水稀释 3.2、牛奶中酪蛋白的提取 3.21、酪蛋白的粗提 50mL 鲜牛奶加热至 40 。在搅拌下慢慢加入预热至 40 、 pH4.7 的醋酸

29、缓冲液 50mL.用精密 pH 试纸或酸度计调 pH 至 4.7。 将上述悬浮液冷却至室温。离心 15 分钟（ 3000 r min-1）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 3.22、酪蛋白的纯化 用水洗涤沉淀 3 次，离心 10 分钟（ 3000rmin-1），弃去上清液。在沉淀中加入 30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇 乙醚混合液洗沉淀 2 次。最后用乙醚洗沉淀 2 次，抽干。将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。 3.3、酪蛋白含量的测定 3.31、标准曲线的绘制与样品的测定 取试管 8 支，按下表操作。 各管混匀、放置 37 水浴中保温 20min。 54

30、0nm 比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。 3.32、计算 在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度 (g L)，并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出 100mL 鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。 3.4 钙含量的测定 3.41、钙制剂钙含量的测定 准确移取 25ml 的鲜牛奶和钙奶，分别转移到 100mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。 准确移取上述试液 20.00mL，加入三乙醇胺溶液 5mL， 5molL-1NaOH 4mL，加入水 20mL，摇匀，加铬蓝黑 R810 滴，用 0.01molL-1EDTA标准溶液滴定，接近终点

31、时再补加 2 3 滴铬蓝黑，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗 EDTA 的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（ g/100mL），并与包装上注明的含量作比较。 3.42、注意事项 量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗 0.01 molL-1EDTA体积为 2030 mL。牛奶、由于钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加 2 3 滴指示剂。 3.5 铁含量的测定 3.51、标准曲线的绘制 取 25mL 比 色管 6 支，按下表顺序配制铁标准系列并记录测量的数据（注意：加入盐酸钱干后需摇匀放置 2 min，再进行下一步操作），加完试剂后摇匀，放置 37 水浴中保温 15

32、min，以空白液为参比，在 510nm 下测定各溶液的吸光度值。 取 25mL 比色管 2 支，按照上表及上述方法测定 510 nm 下的吸光度值。 3.52、计算 在电脑上以吸光度值为纵坐标，以铁质量浓度（ gmL）浓度为横坐标绘制标准曲线。 利用标准曲线计算鲜奶中铁的含量（ mg/100mL）。 3.53、样品的测定 将 50ml 鲜奶一滴一滴加到热 坩埚中避免沸腾蒸发。除去水份后 , 强烈加热至 450550 1小时。冷却后 , 加 1 mL 浓硝酸蒸发近干 , 重新在 450550 灼烧（不能溅出）。用少量稀硝酸溶解白色残液 , 转入 10mL 容量瓶中稀释至刻度 , 用稀氢氧化钠溶液

33、调 pH=78。 3.6 锌含量的测定 3.61、标准曲线的绘制与样品的测定 将 70ml 鲜奶一滴一滴加到热坩埚中避免沸腾蒸发。除去水份后 , 强烈加热至 450550 1 小时。冷却后 , 加 1 mL 浓硝酸蒸发近干 , 重新在 450550 灼烧（不能溅出）。用少量稀硝酸溶解白色残 液 , 转入 10mL 容量瓶中稀释至刻度 , 用稀氢氧化钠溶液调 pH=78。再用蒸馏水稀释到 25ml. 可准确吸取 1ml 水样，用纯水稀释至 10.0mL。 另取分液漏斗 8 个，依次加入锌标准溶液 0、 0.50、 1.00、 1.50、 2.00、 3.00、 4.00 和 5.00mL，各加纯

34、水至 10mL。 向水样与标准系列分液漏斗中各加 1 滴甲基红指示剂，用 1 1 氨水调节溶液刚显黄色，再滴加乙酸溶液至红色（ pH 约 4.4）。加 5mL 四氯化碳，振摇萃取甲基红，弃去有机相。 向各分液漏斗中加入 5.0mL 缓冲溶液混匀，再加入 1.0mL 硫代硫酸钠溶液，混匀，再加入10.0mL 双硫腙四氯化碳溶液，强烈振荡 4min，静置分层。 用脱脂棉或卷细的滤纸擦去分液漏斗颈内的水，弃去最初放出的 2 3mL 有机相，收集随后流出的有机相于干燥的 10mL 比色管内。于 535nm 波长下，用 1cm 比色皿，以四氯化碳为参比，测定样品和标准系列溶液的吸光度。绘制校准曲线，在曲线上查出样品管中锌的含量。 注： 本法测锌要特别注意防止外界污染，同时还要避免在直射阳光下操作。 加入硫代硫酸钠除了掩蔽干扰金属离子的作用外，同时也兼有还原剂的作用，保护双硫腙不被氧化。 由于硫代硫酸钠也能与锌离子络合，因此标准系列中硫代硫酸钠的加入量应与样品管一祥。 振荡时间必须充分，因硫代硫酸钠是较强的络合剂，只有使锌从络合物 Zn(S2O3)2-中释放出来，才能被双硫腙四氯化碳溶液萃取。而锌的释放又比较缓慢，因此振荡时间要保证4min，否则萃取不完全。为了使样品和标准的萃取率一致，应尽量做到振摇强度、次数一致。