1、课程： 基础生物化学实验 学院： 班级： 学号： 姓名： 成绩： 评阅教师： 实验一 蛋白质的等电点和含量测定 1蛋白质的等电点测定 （ pH值沉淀法 ） 一、实验目的 1学习和掌握蛋白质的两性解离性质。 2掌握 pH值法测定蛋白质等电点的一般原理和操作方法。 二、实验原理 三、试剂与仪器、耗材 1试剂 2仪器耗材 四、实验方法 取 4 支同样规格的试管，按下表顺序分别精 确地加入各试剂，加入后立即混匀，加一管，摇匀一管。静置，观察各管在不同时间的混浊度。观察时可用 +，+， +，表示浑浊度。 表 1 试剂 管号 H2O /mL 0.01 mol/L HAC /mL 0.10 mol/L HA
2、C/mL 1.00 mol/L HAC/mL pH 蛋白质溶液 /mL 观察现象 0 min 10 min 20 min 1 2 3 4 五、实验结果、计算与分析 1.观察各管中清澈度变 化，记录结果并解释现象 . 2.确定酪蛋白的等电点。 六、思考题 蛋白质在等电点沉淀的原因是什么？影响该实验结果准确性的因素有哪些？ 2. 双缩脲法测定蛋白质含量 一、实验目的 1学习双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理。 2学习和掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的实验操作方法。 二、实验原理 三、试剂与仪器、耗材 1试剂 2仪器耗材 四、实验方法 1.制标准曲线 取试管 6支，编号 0-5，按下表顺序加入各试剂。 表
3、 2 试剂 /mL 试管 0 1 2 3 4 5 标准牛 血清白蛋白 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质含量 mg/mL 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 上述试剂加完后，充分混匀，室温放置 30 min。以 0号管为对照管，于 540 nm 处比色测定吸光值，记下各管吸光度，以每管蛋白质含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标，作吸光度 -蛋白质含量标准曲线。 2样品测定 五、实验结果、计算与分析 1使用 Excel 程序绘制标准曲线，计算回归方程。
4、 2 利用回归方程，取两组测定的平均值按下列公式计算蛋白质的含量： 样品蛋白质含量（ mg/100 mL） =Y N 100/V 式中， Y为标准曲线查得的蛋白质的量（ mg）， N为稀释倍数， V为样品所取的体积（ mL）。 六、思考题 影响标准曲线准确性的因素有哪些？ 注意事项： 1标准曲线选择不能只看 R2，还应该看曲线斜率和截距。 R2 大小与实验操作和仪器都有关系。 2显色时间过长，可能会出现雾状沉淀，影响比色。（解决方法：尽快比色） 3脂肪性物质会影响反应。 （可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上澄清液再测） 4测定样品管吸光度时，其吸光值应界于标准曲线范围内，如超出，应适当稀释样品后再测。
