1、支链氨基酸对模拟失重大鼠肌萎缩的干预 作用 1 李红毅，白树民，黄贱英，韩晓龙，朱德兵，雷浪伟，陈朴 （中国航天员科研训练中心，航天医学基础与应用国家重点实验室，航天营养与食品工程重点实验室 北京 100094） 摘要 ： 目的 观察支链氨基酸（ BCAA）对模拟失重条件下大鼠肌萎缩的 干预 效果。 方法 尾部悬吊法建立模拟失重模型， SD雄性大鼠随机分为地面对照组（ GC组）、尾吊对照组（ TC组）及尾吊支链氨基酸干预组（ TBI组）， GC组和 TBI组经人工灌胃的方式分别给予对应剂量的纯净水和支链氨基酸溶液，饲养 4周 后取血和比目鱼肌，按相关方法测定其相关各项指标。 结果 与 GC组比
2、较，TC组大鼠比目鱼肌（ SOL）湿重和湿重 体质量 比均显著减少（ P0.01），血清 BUN、 Ub水平显著升高（ P0.05）， IGF-1、 TESTO、SOD、 GSH-Px水平显著降低（ P0.05）， Atrogin-1蛋白表达水平增加 32%。与 TC组比较， TBI组大鼠 SOL的湿重和湿重 体质量 比均显著增加（ P0.01）；血清 IGF-1、 TESTO、 Ub均增加，其中 TESTO水平增加显著（ P0.05）， BUN水平减小，血清 SOD、 GSH-Px活 力水平均显著增加（ P0.05）； Atrogin-1蛋白表达水平显著减小（ P0.05）。 结论 BCAA
3、可能通过刺激体内的合成代谢激素的分泌、提高体内抗氧化能力以及抑制 Atrogin-1蛋白表达等机制，在一定程度上促进骨骼肌蛋白的合成，抑制骨骼肌蛋白的分解，从而减轻尾吊条件导致的肌萎缩。 关键词： 支链氨基酸；模拟失重；肌萎缩； 干预 作用 中图分类号： 单击此处键入中图分类号 文献标识码： A 文章编号： THE PROTECTIVE EFFECTS OF BRANCHED-CHAIN AMINO ACID ON MUSCLE ATROPHY IN WEIGHTLESSNESS-SIMULATED RATS LI HONG-YI， BAI SHU-MIN， HUANG JIAN-YING,
4、HAN XIAO-LONG, ZHU DE-BING， LEI LANG-WEI， CHEN PU （ Chinese Astronaut Research and Training Center ， State Key Lab of Space Medicine Fundamentals and Application， Key Laboratory of Space Nutrition and Food Engineering; Beijing 100094; China） ABSTRACT： Objective To investigate the protective effects
5、of branched-chain amino acid（ BCAA） on muscle atrophy in weightlessness-simulated rats. Methods Weightlessness was simulated by tail-suspended model in rats. SD rats were randomly divided into 3 groups : ground control group (GC), tail-suspended control group (TC) and tail-suspended BCAA interventio
6、n groups (TBI). They were successively fed with normal diets、 pure water and BCAA solution via intragastric administration. The biochemical indices of serum and SOL were detected after 4 weeks. Results Compared with GC group, the rats muscle wet weight(MWW) of SOL and the ratio of MWW to body weight
7、 were significantly decreased(P0.01),the level of BUN and Ub in serum were significantly increased （ P0.05）， the level of IGF-1、 TESTO、 SOD、 GSH-Px in serum were significantly decreased（ P0.05） and the expression of atrogin-1 protein in SOL decreased by 32% in TC group. Compared with TC group, muscl
8、e wet weight(MWW) of SOL and the ratio of MWW to body weight were significantly increased (P0.01) in TBI group， the same tendency was observed on the serum level of IGF-1、 TESTO、 Ub， particularly for TESTO (P0.05)， the serum BUN was decreased， the level of SOD and GSH-Px were increased significantly
9、 (P0.05）， and the expression of 收稿日期 2014-06-10 基金项目 中国载人航天工程基金资助项目（ No.92110HY-4）；国家自然科学基金资助项目 （ No.81202612） 作者简介 李红毅（ 1979-），男，硕士研究生。从事航天营养学研究。 atrogin-1 protein in SOL decreased in TBI groups（ P0.05） .Conclusion BCAA may promote the synthesis but inhibit the breakdown of SOL protein to some exte
10、nt， ultimately to lessen SOL atrophy in tail-suspended rats， The mechanism was the potential facilitating secretion of anabolic hormone and the antioxidate ability， furthermore inhibiting the expression of atrogin-1 protein and the like. KEY WORDS BCAA； weightlessness-simulated； muscle atrophy； prot
11、ective effect 研究表明，航天员长期处于 失重状态下 ， 肌肉蛋白代谢会发生 明显变化 ，从而 最终导致肌萎缩 1。若无有效对干预 措施 ， 肌萎缩将 严重影响航天员的工作效率和 适应能力。因此 干预 失重性肌萎缩始终是 国内外 航天医学工作者关注的 重点 之一 。 近年来以支链氨基酸 (branched-chain amino acid，BCAA） 为原料的功能食品成为国内外研发的热点。支链氨基酸是对亮氨酸 (（ leucine， Leu)、异亮氨酸 (Isoleucine，Ile)与缬氨酸 (Valine， Va1)的统称，其结构相似，碳链中都有分支，是机体不能合成而由食物蛋白
12、提供的三种必需氨基酸， BCAA主要在肌肉中代谢，是长时间持续运动时参与供能的重要氨基酸 2。运动医学研究表明：补充 BCAA能促进肌肉蛋白质的合成，防止蛋白质的降解；关于支链氨基酸对失重肌萎缩 干预 作用的研究， NASA曾以营养素补充剂 应用于航天员 3，但国内文献未见报道。 本实验采用 支链氨基酸作为营养干预措施，观察其对模拟失重 大鼠肌肉萎缩的 干预 效果，并探讨 其 可能 的 作用机制，从而为失重性肌萎缩营养干预措施 的制定提供新的线索。 1 材 料 与 方 法 1.1 实验对象与分组 健康雄性 SD 大鼠（北京维通利华实验动物中心）， 8周 龄， 体质量 (145 5)g，适应性饲
13、养 1 周 后按 体质量 随机分为地面对照组（ GC）、尾吊对照组（ TC）、尾吊支链氨基酸干预组（ TBI），每组 10只大鼠 。 1.2 动物饲养 大鼠饲养于中国航天员科研训练中心 SPF 级动物实验室的不锈钢笼内，每笼 1只， 室温（ 20 24），人工控制室内照明，昼夜周期 12h/12h。 GC 组和 TC 组大鼠每天 自由进食清洁级普通颗粒饲料（ 军事医学科学院实验动物中心，批号 201006020），同时 灌胃 1ml/(kg bw)的纯净水， TBI 组 同 GC 组和 TC 组，同时 灌胃相应剂量1.6ml/(kg bw)的 支链氨基酸溶液（ 三种支链氨基酸的比例（ mol）
14、为 Leu:Ile:Val=2:1:1） 。 TC组和 TBI组按陈杰等的方法进行尾部悬吊 4，连续悬吊 28d。全部大鼠 每 5d称量一次 体质量 ，根据 体质量 结果及时调整灌胃量。 1.3 取材 及处理 实验结束当天，禁食 8h 后断头取血，分离血清，置于 -70冰箱待测；断头采血后 迅速取左后肢比目鱼肌(soleus， SOL)称重 ，后 置于 2ml 冻存管中 于液氮中冷冻保存。 1.4 测定指标及方法 每组每只大鼠平均每日摄食量和 体质量 （ body weight， BW） 采 用 称重法计算 ； 比目鱼肌 湿重（ soleus muscle wet weight， MWW）采用
15、电子分析天平称量 ，并计算湿重 体质量 比（ MWW/BW）；血清尿素氮（ blood urea nitrogen， BUN）采用二乙酰 -肟比色法进行测定；超氧化物歧化酶（ superoxide dismutase， SOD）活力采用黄嘌呤氧化酶法；谷胱甘肽过氧化物酶（ glutathione peroxidase， GSH-Px）活力采用二硫代二硝基苯甲酸（ DTNB）直接法； 泛素（ ubiquitin， Ub）、 胰岛素样生长因子 1（ insulinlike growth factor-1,IGF-1）、睾酮（ testosterone， TESTO）均采用酶联免疫吸附法测定；比目鱼
16、肌中 atrogin-1 蛋白表达采用 Western-blot 法测定。 1.5 主要试剂与仪器 支链氨基酸（北京惠康源生物科技有限公司），酶联免疫吸附法测定试剂盒（美国 Rapidbio公司）， SOD和GSH-Px活性测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），atrogin-1抗体（美国 ECM bioscience公司），二抗（美国Santa Cruz公司）； MULTISKAN-MK3型全自动多功能酶标仪（美国 Thermo公司），日本岛津 CL-770型生化分析仪，UV-2000 型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯科学仪器有限公司）， BT124S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限
17、公司）。 1.6 数据处理 采用 SPSS 13.0 软件进行 单因素 方差分析 ，组间差异采用 LSD 检验，数据以均值标准差（ x s）表示，检验水准为 P0.05。 2 结 果 2.1 体质量 及比目鱼肌湿重的变化 表 1 大鼠 体质量 及比目鱼肌湿重 变化 (x s， n=10) 组别 摄食量 （ g/d） 体质量 （ g） 比目鱼肌湿重 (mg) 湿重 体质量 比 （ mg/g） GC 26.284.81 302.0022.61 132.5612.48 0.440.02 TC 19.864.05* 234.5018.39* 62.405.68* 0.270.01* TBI 21.35
18、4.63 252.3813.47# 87.706.20# 0.35 0.02# 与 GC 组比较： * *P0.01 ；与 TC 组比较： # P0.05， # P0.01 从表 1 可见， 实验结束时，与 GC 组 相比较， TC 组大鼠 体质量 和摄食量均显著下降（ P0.05）， SOL 湿重和湿重 体质量 比均显著减少（ P0.01），而且变薄变细，呈长薄片状，弹性减退，重量减轻，而 GC 组大鼠 SOL 呈长扁条状，红润饱满，富有弹性；与 TC 组相比， TBI 组大鼠SOL 的湿重和湿重 体质量 比均显著增加（ P0.01）。 2.2 血清 Ub、 IGF-1、 TESTO 水 平
19、的变化 表 2 血清 Ub、 IGF-1、 TESTO 检测结果 （ x s， n=10） 组别 IGF-1（ ng/ml） TESTO（ ng/ml） Ub（ ng/ml） BUN(mmol/L) GC 29.392.16 3.440.94 1.070.33 4.660.55 TC 25.031.65* 1.470.24* 1.380.25* 6.390.84* TBI 27.112.69 2.290.56# 1.500.45 6.221.33 与 GC 组比较： * P0.05 ， * P0.01；与 TC 组比较： ， # P0.05 从表 2看出，与 GC 组 相比较， TC 组大鼠血
20、清 Ub、 BUN水平显著增加（ P0.05）， IGF-1、 TESTO 水平显著降低（ P0.05）；与 TC组相比， TBI 组血清 IGF-1、 TESTO、 Ub均增加， BUN 水平减小，其中 TESTO 水平显著增加（ P0.05）， IGF-1、 BUN、 Ub 水平变化不显著。 2.3血清 SOD、 GSH-Px 活力水平的变化 表 3 大鼠 血清 SOD 、 GSH-Px 活力变化结果 （ U/ml ,x s, n=10） 组别 SOD GSH-Px GC 170.1410.98 400.7518.07 TC 151.2310.46* 378.2110.81* TBI 16
21、0.4010.68# 395.4625.51# 与 GC 组比较： *P0.01；与 TC 组比较： #P0.05 从表 3 看出，与 GC 组相比较， TC 组大鼠血清 SOD、GSH-Px 活力水平显著降低（ P0.01）；与 TC组相比， TBI组血清 SOD、 GSH-Px活力水平均显著增加（ P0.05）。 2.4 大鼠比目鱼肌 atrogin-1蛋白的表达 表 4 大鼠比目鱼肌 atrogin-1蛋白 灰度值比较 （ x s， n=3） 组别 Atrogin-1/-actin GC 0.150.01 TC 0.200.01* TBI 0.170.01# 与 GC 组比较： * P0
22、.01；与 TC 组比较： # P0.05 T B I G C T Ca tr o g in - 1 - a c ti n 图 1 大鼠比目鱼肌 atrogin-1 蛋白表达 从表 4、图 1 可以看出，与 GC 组相比较， TC 组大鼠atrogin-1 蛋白表 达水平明显增加，比值为 132%；与 TC组相比， TBI 组的 atrogin-1 蛋白表达水平显著减小（ P0.05），提示补充 BCAA 后，其比目鱼肌中 atrogin-1蛋白质表达水平降低。 3 讨 论 在航天生理学研究中，尾吊大鼠作为模拟失重肌萎缩的模型，通常以比目鱼肌的肌肉质量等指 标来衡量肌萎缩的程度。本实验中，大鼠
23、尾吊 28 天后， SOL 变薄变细，弹性减退、体积和重量均明显减小，这一结果与以往研究基本一致 ,经 补充 BCAA 后， SOL 湿重增加了约 41%，湿重体质量 比增加了约 30%。结果提示， BCAA 可有效减缓模拟失重所导致的比目鱼肌质量的减少。 大量研究证实，失重条件下的肌萎缩与机体激素水平的变化密切相关， IGF-1、 TESTO和 Ub是参与机体骨骼肌蛋白质代谢的重要激素。其中 IGF-1、 TESTO参与骨骼肌蛋白的合成代谢， IGF-1能显著增强骨骼肌蛋白的合成代谢 5，而 TESTO可通过增加 IGF-1水平间接增强骨骼肌蛋白的合成 6； Ub是一种球形蛋白，是泛素蛋白酶
24、体途径的重要参与者，而泛素蛋白酶体途径是失重条件下蛋白分解的重要途径 7， BUN是机体蛋白质分解代谢的终产物。本实验观察到尾吊对照组大鼠的 IGF-1、 TESTO水平显著降低，这可能与尾吊大鼠骨骼肌蛋白合成率降低有关，而 Ub、 BUN水平显著增加则可能与尾吊大鼠骨骼肌蛋白分解率增加有关。而大鼠 补充 BCAA后，机体的 IGF-1、 TESTO水平均有升高的趋势，表明 BCAA可在一定程度上刺激 IGF-1、 TESTO的分泌，从而促进肌肉蛋白的合成，这可能与 Leu的功能有关， Leu是酮异己酸（ KIC）和 -羟基丁酸盐（ HM）的前体， KIC、 HM可以刺激 IGF-1、 TES
25、TO等激素的分泌 8；然而对机体 Ub和 BUN水平的 影响 并不明显。 尾吊 大鼠会发生氧化应激， 进而 加重肌肉萎缩 8。氧化应激是机体活性氧基团水平超过抗氧化防御系统能力的一种状态，文献报道 ， 能量摄入不足会降低机体抗氧化系统的作用效果 1。 SOD、 GSH-Px是机体酶抗氧化防御系统中的重要成员，本实验观察到尾吊对照组大鼠 SOD、GSH-Px活力水平显著降低，表明 尾吊条件导致了大鼠体内氧化应激，另外还观察到尾吊对照组 大鼠 体质量 显著下降，这很可能与其 能量摄入不足 有关。而补充 BCAA后，大鼠的 SOD和 GSH-Px活力 均明显升高， 体质量 也有所增加，说明补充一定剂
26、量 的 BCAA可以提升机体 SOD和 GSH-Px的活力 ，从而 减轻由氧化应激所导致的肌肉萎缩。 据此 推测BCAA改善机体氧化应激状态的途径可能是： （ 1）通过阻断活性氧自由基的链反应，使过氧化反应的终产物生成减少，从而使 SOD、 GSH-Px未被大量消耗而维持正常活性；（ 2）使 SOD、 GSH-Px生成增加。 近年研究发现 ， 泛素蛋白酶体途径是失重条件下骨骼肌蛋白分解的主要途径，而 atrogin-1被认为是失重条件下骨骼肌蛋白降解过程中的关键蛋白酶，是泛素蛋白酶体途径中的限速环节 7。本实验中尾吊对照组大鼠的atrogin-1蛋白表达水平显著增加，说明尾吊条件下大鼠骨骼 肌
27、蛋白分解增加。而补充 BCAA组大鼠 atrogin-1蛋白表达水平下降，说明摄入一定剂量的 BCAA可以抑制atrogin-1的过表达，从而减轻骨骼肌蛋白分解的程度。由于泛素蛋白酶体途径是一种依赖 ATP能量转换途径，补充 BCAA是否影响到该途径中的 ATP能量传递，从而影响到atrogin-1蛋白表达，其确切机制仍然有待进一步研究。 本实验中，补充 BCAA可能通过刺激体内的合成代谢激素的分泌、提高体内抗氧化能力以及抑制泛素蛋白酶体途径中的 atrogin-1蛋白表达等机制，在一定程度上促进骨骼肌蛋白的合成，抑制骨 骼肌蛋白的分解，从而减轻尾吊条件导致的肌萎缩。 参考文献 ： 1 韩忠宇
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29、悬吊模型 J.空间科学学报 ,1993,13: 159-162. 5 DAY CS. Insulin growth factor-1 decreases muscle atrophy following denervationJ.Microsurgery,2002,22:144-151. 6 KAMEL HK,MAAS D,DUTHIE EHJ.Role of hormones in the pathogenesis and management of sarcopeniaJ.Drugs and Aging,2002,19:865-877. 7 CAO PR, KIM HJ, LECKER SH. Ubiquitin-protein ligases in muscle wastingJ. Int J Biochem Cell Biol,2005,37: 25. 8 LAWLER JM, SONG W, DEMAREE SR. Hindlimb unloading increases oxidative stress and disrupts antioxidant capacity in skeletal muscleJ.Free Radic Biol Med， 2003,35:9-16.
