1、1高效液相色谱法测定米糠中的水溶性维生素（江南大学化工与材料工程学院，江苏无锡 214122）摘要：高效液相色谱法同时测定米糠中四种水溶性维生素 VB1，VB 6，烟酸，烟酰胺的含量。在 Hypersil C18 （250 cm4.6 mm i.d., 5.0 m）上，以体积比为88:12 的 0.1磷酸水溶液-甲醇为流动相，以 0.6 mL/min 流速等度洗脱，在266nm 波长下检测。各组分在 8min 能基线分离。四种维生素在 0.610-6g/mL8.510 -5g/mL 范围内呈线性关系，VB 1、 VB6、烟酸和烟酰胺的检出下限分别为 0.4310-6 g/mL、0.3410 -
2、6g/mL、0.3210 -6 g/mL、0.3010 -6 g/mL。经简单预处理，可以对米糠和淘米水中的这四种维生素的含量进行测定，平均回收率在 96.099.9之间。该法简便、快速、准确、灵敏，对复杂体系水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。关键词：水溶性维生素；米糠；高效液相色谱Determination of four water-soluble vitamins in rice bran by reverse-phase high performance liquid chromatographyCAO Rui, CAO Yu-hua, LI Nan, GONG Wen-jun,
3、KONG Ling-yao, WANG YunSchool of Chemical and Material Engineering, Southern Yangtze University, Wuxi 214122Abstract: High performance liquid chromatography (HPLC) has been applied for the simultaneous determination of four kinds of water-soluble vitamins including vitamin B1, vitamin B6, nicotinic
4、acid, and nicotinamide in rice bran. The separation was performed on a Hypersil C18 column (250 cm4.6mm i.d., 5.0 m) with a mobile phase of 0.1% H3PO4- methanol (88:12, V/V) at flow rate of 0.6 mL /min, and detection wavelength was 266 nm. Four vitamins had good linearity in the range of 6.010-7g/mL
5、 - 8.510-5g/mL, with detection limit of 4.310-7 g/mL, 3.410-6g/mL, 3.210-7g/mL and 3.010-7 mg/L for vitamin B1, vitamin B6, nicotinic acid and nicotinamide, respectively. Baseline separation of four vitamins can be achieved within 8 minutes. Without complicated pretreatment, four analytes in rice br
6、an samples, as well as extracts from rice with water, were successfully determined with 2recoveries between 96.0% and 99.9%. The approach could be applied to determine water-soluble vitamins in complicated samples owing to simplicity, convenience, sensitivity and accuracy. Key words: water-soluble v
7、itamins; rice bran; high performance liquid chromatography米糠是一类具有广泛开发潜力的高附加值资源，含有稻米的 64营养物质及 90人体所需要的各种营养元素 1，包括维生素、氨基酸、脂肪酸、矿物质，还有米糠多糖、二十八碳烷醇、神经酰胺等生理功能卓越的活性物质 2。其中水溶性维生素是一类重要的营养成分，在各种保健品 3，功能型饮料中得到应用。烟酸和烟酰胺能够促进头皮血液循环，防止脱发；VB 6 具有美发功效；VB1 具有滋养与深层清洁的作用，因此化妆品中也常添加微量的维生素 4。淘米水中也含有维生素，用淘米水洁肤洗发，刺激性小，有润肤护发
8、功效。因此，测定米糠和淘米水中的维生素含量很有必要。测定维生素的方法有紫外分光光度法 5、荧光法 6和高效液相色谱法（HPLC） 7。但 HPLC 技术用于米糠中水溶性维生素的测定还未见报道。本文采用 HPLC 建立了米糠及淘米水中的水溶性维生素的测定方法，对样品前处理方法进行了研究，对测定体系各影响因素进行了优化。方法简便快速，准确可靠，对复杂体系中水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。1 实验部分1.1仪器、试剂与样品仪器： Waters505 高效液相色谱仪（包括 2487 紫外检测器） ， Empower色谱工作站。色谱柱：Hypersil C18（250 cm4.6mm i.d.,
9、5.0m） 。超声波振荡器（BRANSON SB 3200T，上海） ；固相萃取柱（固相 PT-系列，河北省津杨滤材厂）等。试剂： VB6（纯度 99） 、烟酰胺（纯度 99） 、烟酸（纯度99.5） 、VB1（纯度 98） 。均购自国药集团化学试剂有限公司（上海） ；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。米糠样品来源于无锡秦良商贸有限公司。3糯米样品产地：云南西双版纳自治州。1.2 色谱条件色谱柱：Hypersil C18 柱（250 cm4.6mm i.d., 5.0m）, 流动相：A: 0.1 %磷酸水溶液, B:甲醇，以体积比 A:B=88:12 等度洗脱；流速为 0.6 mL/
10、min。检测波长：266nm；进样量 20 L。1.3 试液的制备1.3.1 标准溶液的制备精确称取约 0.05g 的四种维生素标准品，用 0.01mol/L 盐酸溶解并稀释到50 mL，摇匀，分别得到 1.3610-3 g/mL，1.1810 -3 g/mL，1.0410 -3g/mL 和1.00 10-3.g/mL 的 VB1，VB 6，烟酸和烟酰胺的标准储备液，于 4冰箱中保存。储备液用流动相稀释得所需浓度的标准溶液。1.3.2 米糠供试品溶液的制备取 10.00g 米糠于 100mL 锥形瓶中，加入 20mL 混合溶剂（体积比为 80:20的甲醇0.01mol/L 盐酸溶液）超声提取
11、30min，过滤，滤渣用相同的条件重复提取两次，合并提取液。用旋转蒸发仪蒸发浓缩，浓缩液用无水乙醚萃取两次脱脂，水相经 0.45m 滤膜过滤，再过固相萃取柱，定容至 10mL 容量瓶中，即得米糠供试品溶液。1.3.3 淘米水供试品溶液的制备取 100g 云南产糯米加 100mL 自来水搅拌 20min，沥出洗米水，然后定容至100mL。过滤，将滤液在 12000r/min 下离心 15min，取上清液，经 0.45m 滤膜过滤，再过固相萃取柱，即得淘米水供试品溶液。2. 结果与讨论2.1 样品预处理 8方法优化米糠的主要成分有蛋白质、脂肪酸、胆甾醇、多糖等。虽然 VB1、VB 6、烟酸和烟酰胺
12、都是水溶性物质，但采用水为提取剂，蛋白质、碳水化合物也会随之被提取出来，干扰测定并污染色谱柱。尝试了纯甲醇以及 90甲醇和 10的 0.01mol/L 盐酸水溶液提取维生素，发现不能将水溶性维生素提取完全；70的甲醇和 30的 0.01mol/L 盐酸水溶液虽能将水溶性维生素提取完全，但米糠中的蛋白质也会随之被提取出来；用 80甲醇和 200.01mol/L 盐酸水溶4液提取，蛋白质会变性产生沉淀，碳水化合物也不溶，而 VB1、VB 6、烟酸和烟酰胺又有较好的溶解度，因此实验采用 80甲醇的酸性水溶液提取三次，浓缩，脱脂，再过固相萃取柱去除残余的干扰物质。糯米淘米水中也含有大量的蛋白质，脂肪酸
13、，多糖等，尝试了用等体积的10的三氯乙酸去蛋白，由于酸性太强，体系不稳定；用 sevag 法去蛋白，需要多次重复，才能较彻底的去除蛋白，比较耗时；而用高转速离心机将蛋白离心下来，分离效果良好。再过固相萃取柱以去除残余的干扰物质，可以避免污染色谱柱。2.2 色谱条件的优化文献中测定 B 族维生素大多采用在流动相中加 KH2PO4 调节酸度或加磺酸盐 7， 9 -11 等离子对试剂抑制分析物的极性，但加盐后会对高效液相色谱仪的泵头产生一定的损伤；还有一些报道采用的是耐水色谱柱 7，11 ，采用全水体系做流动相，但耐水色谱柱价格昂贵。本实验采用普通的 C18 色谱柱，在流动相中加入稀酸调节酸度，对
14、B 族维生素进行测定。实验中首先尝试流动相为 0.6醋酸水溶液甲醇（体积比为 88:12）等度洗脱，对四种水溶性维生素进行分离，发现烟酸和 VB6 在此条件下不能分开。也尝试了 0.05三氟乙酸甲醇体系，四种维生素同样无法得到分离。将流动相中的水相改换为磷酸水溶液，调整磷酸浓度来实现四种水溶性维生素的分离。实验中尝试了 0.08，0.10，0.12的磷酸水溶液进行实验。采用 0.08磷酸水溶液时，四种维生素混合标准溶液得到了较好的分离。但是米糠实际样品测定时，发现 VB1、VB 6 与相邻未知物质的峰未达到完全分离。改用 0.1磷酸水溶液，米糠样品中的待测维生素分离的较好；换用 0.12磷酸水
15、溶液时，效果与 0.1磷酸水溶液相当。但酸性加大会对柱子有一定的伤害，综合各种因素，选用 0.1磷酸水溶液甲醇体系，以体积比为 88:12 等度洗脱。考察了 0.1磷酸水溶液与甲醇不同配比时对四种维生素分离的影响，发现流动相中水相比例降到 85时四种维生素无法达到分离，水相比例为 88时，四种维生素在 8min 内达到基线分离。在上述优化色谱条件下得到 4 种维生素的标样图，见图 1Mv0.2.40.6.80.1.20.14. 分2.04.06.08.010.12.014.016.01234t/min5图 1 水溶性维生素混合标准溶液色谱图峰标：1.VB 1； 2.烟酰胺；3.烟酸；4.VB
16、62.3 方法学评价2.3.1 重现性试验取 4 种维生素的标准储备液等体积混和，然后稀释 16 倍，在上述优化实验条件下连续 5 次进样，测得其峰面积及保留时间的相对标准偏差（RSD）均小于 2，结果表明其重现性较好。如表 1 所示表 1 重现性试验RSD（%） (n=5)组分 保留时间 峰面积VB1 0.04 0.70烟酸 0.05 0.50VB6 0.12 2.0烟酰胺 0.04 0.792.3.2 标准曲线及检出限配置了一系列不同浓度的 VB1、VB 6、烟酸和烟酰胺的混合标准溶液，在优化的实验条件下，进行了测定，得出各组分的线性回归方程、线性范围，并以 3 倍信噪比得到检测限，结果如
17、表 2 所示。结果显示线性范围宽，检测限低。表 2 回归方程及检测限62.4 样品的测定及回收率实验按 1.3.2 和 1.3.3 方法处理好样品，在优化好的色谱条件下，进行测定。米糠样品的色谱图见图 2；米糠及淘米水中维生素测定结果见表 3。Mv0.50.10.150. 分2.04.06.08.010.12.014.016.01234图 2 米糠样品的色谱图表 3 米糠及糯米淘米水中维生素的测定结果 (n=3)取米糠供试液做加标回收试验。结果见表 4。回收率在 96.099.9，结果可靠。表 4 4 种水溶性维生素的回收率测定结果 （n=3）组分 线性范围/（g/mL ） 回归方程 R2 检
18、测限/ (g/mL）VB1 8.510-78.510-5 Y=5.84107X+28.42 0.9999 4.310-7烟酸 9.310-76.510-5 Y=4.91107X+7.07 0.9999 3.210-7VB6 1.010-67.410-5 Y=1.45107X+65.27 0.9999 3.410-7烟酰胺 6.010-76.210-5 Y=6.06107X5.91 0.9999 3.010-7样品 组分 含量 RSD（）VB1 7.710-6 g/g 1.6烟酸 14.910-6 g/g 2.1VB6 1.310-6 g/g 1.2米糠烟酰胺 16.210-6 g/g 0.7V
19、B1 0.910-6 g/mL 2.0烟酸 5.910-6 g/mL 0.9VB6 未检出 淘米水烟酰胺 1.610-6 g/mL 2.1t/min7维生素 试液浓度(g/mL)加标准试液(g/mL)测定含量(g/ml) 平均回收率/(%)RSD/(%)VB1 7.610-6 8.510-6 15.7610-6 96.0 0. 5VB5 14.810-6 6.510-6 21.0710-6 96.4 1.6VB6 1.310-6 7.410-6 8.6910-6 99.9 4.9烟酰胺 16.410-6 6.310-6 22.810-6 98.0 3.03. 结语：采用 80甲醇的 0.01
20、mol/L 盐酸溶液超声提取，石油醚脱脂，并经固相萃取柱除去杂质，对米糠和淘米水试样进行了提取和纯化。采用普通的 C18 液相色谱柱，在流动相中加入稀酸调节酸度，可以简单、快速地测定米糠中的四种水溶性维生素 VB1，VB 6，烟酸，烟酰胺。本法简便准确、可靠、重现性好，对复杂体系中的水溶性维生素的测定具有一定的参考意义。同时本文的测定结果也为开发天然绿色米糠化妆品提供了一定的依据。参考文献1毛金水,贺绪军 ,李翔,等.米糠营养素提取的研究与生产应用J.副产物综合利用,2005,34(6) :45472刘元法,王兴国 ,倪伯文,等.米糠活性物质二十八醇功能性研究J.中国油脂,2001,26(5)
21、:63653吴淑君,庄志辉 ,朱孟丽,等.高效液相色谱法测定保健品中的 6 种水溶性维生素及咖啡因J.色谱,2006,24(3):3194张秀真,高素莲 .RP-HPLC 法测定美容液中水溶性维生素的含量J .安徽大学学报(自然科学版),2005,29(6) :79815 陈恕华.紫外分光光度法测定维生素 B6J.理化检验化学分册 ,2005,41(7):519、5216高甲友,吴曙 .荧光光度法测定维生素 B1J.理化检验化学分册 ,1999,35(3):1331347贺利民,吕岱竹 ,苏贻娟.高效液相法同时测定多种水溶性维生素J.海南大学学报自然科学版,2004,22(1):54568于林梁,黄晓兰 ,吴惠勤.饲料中生物素的高效液相色谱测定J.分析测试学报,82003,22(5):1021049崔蓉,李皎 ,王洪玮.水溶性维生素的高效液相色谱测定方法的研究J.中国卫生检验杂志,2005,15(1) :555710丰烨华,张萍 ,孔祥虹,等.高效液相色谱法同时测定扁桃仁中的水溶性维生素C,B1,B2 和 B6J.色谱,2005,23(5):53854111蒋晔,刘红菊 ,郝晓花.反相高效液相色谱法同时测定 9 种水溶性维生素J.药物分析杂志,2005,25(3) :339341
