核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法.doc

1、三、 核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法 50TAE Buffer (pH8.5) 组份浓度 2 M Tris-醋酸， 100 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于 1 L 烧杯中。 Tris 242 g Na2EDTA2H2O 37.2 g 2.向烧杯中加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加入 57.1 ml 的 乙 酸，充分搅拌。 4.加去离子水将溶液定容至 l L 后，室温保存。 10TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度 890 mM Tris-硼酸， 20 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 l.称量下列试剂，置于 l L

2、烧杯中。 Tris 108 g Na2EDTA2H2O 7.44 g 硼酸 55 g 2.向烧杯中加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至 l L 后，室温保存。 10MOPS(3-吗啉基丙磺酸 )Buffer 组份浓度 200 rnM MOPS， 20 mM NaOAc， 10 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1.称 41.8 g MOPS，置于 1 L 烧杯中。 2.加约 700 ml DEPC 处理水，搅拌溶解。 3.使用 2 N NaOH 调节 pH 值至 7.0。 4.再向溶液中加入下列试剂。 1 M NaOAc(DEPC 处理 ) 20

3、 ml 0.5 M EDTA(pH8.0)(DEPC 处理 ) 20 ml 5.用 DEPC 处理水将溶液定容至 1 L。 6.用 0.45 m滤膜过滤除去杂质。 7.室温避光保存。 注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。 溴乙锭 (10 mg/ml) 组份浓度 10 mg/ml 溴乙锭 配制量 100 ml 配制方法 1.称量 1 g 溴乙锭，加入到 100 ml 容器中。 2.加入去离子水 100 ml，充分搅拌数 h 完全溶解溴乙锭。 3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 4.溴乙锭的工作浓度为 0.5 g/ml。 注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作

4、。 Agarose 凝胶 配制方法 1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液 (通常是 0.5TBE 或 1TAE)。 2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中。 3.加入一定量的电泳缓冲液 (总液体量不宜超过锥形瓶的 50%容量 )。 注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。 4.在锥形瓶的瓶封上保 鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。小心摇动锥形瓶。使琼脂糖充分均匀熔化。此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化。必须注意，在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖

5、凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。熔化琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全熔化，否则，会造成电泳图像模糊不清。 5.使溶液冷却至 60 左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液 (终浓度 0.5 g/ml)。并充分混匀。 注：溴乙锭是一种致癌物质。使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好手套。 6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度 一般在 35 min之间。 7.在室温下使胶凝固 (大约 30 min1 h)，然后放置于电泳槽中进行电泳。 注：凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在 4 下保存，一 般可保存 25 天。 琼脂糖凝胶浓度与线形 DNA 的最佳分辨范围 琼脂糖浓度 最佳线形

6、 DNA 分辨范围 (bp) 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0% 1,00030,000 80012,000 50010,000 4007,000 2003,000 502,000 6 Loading Buffer(DNA 电泳用 ) 组份浓度 30 mM EDTA 36%(V/V) Glycerol 0.05%(W/V) Xylene Cyanol FF 0.05%(W/V) Bromophenol Blue 配制量 500 ml 配制方法 1.称量下列试剂，置于 500 ml 烧杯中。 EDTA 4.4g Bromophenol Blue 250 mg Xylene

7、 Cyanol FF 250 mg 2.向烧杯中加入约 200 ml 的去离子水后，加热搅拌充分溶解。 3.加入 180 ml的甘油 (Glycerol)后，使用 2 N NaOH调节 pH值至 7.0。 4.用去离子水定容至 500 ml 后，室温保存。 10 Loadlng Buffer (RNA 电泳用 ) 组份浓度 10 mM EDTA 50%(V/V) Glycerol 0.25%(W/V) Xylene Cyanol FF 0.25%(W/V) Bromophenol Blue 配制置 10 ml 配制方法 1.称量下列试剂，置于 10 ml 离心管中。 0.5 M EDTA(pH

8、8.0) 200 l Bromophenol Blue 25 mg Xylene Cyanol FF 25 mg 2.向离心管中加入约 4 ml 的 DEPC 处理水后，充分搅拌溶解。 3.加入 5 ml 的甘油 (Glycerol)后，充分混匀。 4.用 DEPC 处理水定容至 10 ml 后，室温保存。 四、 核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法 20SSC 组份浓度 3.0 M NaCl， 0.3 M Na3citrate2H2O(柠檬酸钠 ) 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于 l L 烧杯中。 NaCl 175.3 g Na3citrate2H2O 88.2 g

9、 2.向烧杯中加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3 滴加 14 N HCl，调节 pH 值至 7.0 后，加去离子水将溶液定容至1 L。 4.高温高压灭菌后，室温保存。 20SSPE Buffer 组份浓度 3.0 M NaCl， 0.2 M NaH2PO4， 0.02 M EDTA 配制量 1.L 配制方法 1.称量下列试剂，置于 l L 烧杯中。 NaCl 175.3 g NaH2PO4H 2O 27.6 g Na2EDTA2H2O 7.4 g 2.向烧杯中加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加 NaOH 调节 pH 值至 7.4(约 6.5 ml 的 1

10、0 N NaOH)。 4.加去离子水将溶液定容至 l L。 5.高温高压灭菌后，室温保存。 50 X DenhardtS溶液 组份浓 度 配制量 500 ml 配制方法 1.称量下列试剂，置于 500 ml 烧杯中。 2.加去离子水约 400 ml，充分搅拌溶解 3.加去离子水将溶液定容至 500 ml。 4.用 0.45m滤膜过滤后，分装成每份 25 ml。 5.-20 保存。 0.5 M 磷酸盐 Buffer 组份浓度 0.5 M Na2HPO4。 配制量 l L 配制方法 1.称量 134 g Na2HPO47H2O 置于 l L 烧杯中。 2.加入约 800 ml 的去离子水充分搅拌溶

11、解。 3.加入 85%的 H3PO4(浓磷酸 )调节溶液 pH 值至 7.2。 4.加去离子水定容至 1 L。 5.高温高压灭菌后，室温保存。 Salmon DNA (鲑鱼精 DNA) 组份浓度 10 mg/ml Salmon DNA 配制量 约 100 ml 配制方法 1.称取鲑鱼精 DNA 2 g 置于 500 ml 烧杯中，加入约 200 ml 的 TE Buffer。 2 用磁力搅拌器室温搅拌 24 h，溶解后加入 4 ml 的 5 M NaCl，使其终浓度为 0.1 M。 3.用苯酚和苯酚 /氯仿各抽提 1 次。 4.回收水相溶液后，使用 17 号皮下注射针头快速吸打溶液约 20 次

12、，1%(W/V) Ficoll 400(菲可 400/水溶性聚蔗糖 400) 1%(W/V) Polyvinylpyrrolidone (聚维酮 /聚乙烯吡咯烷酮 ) 1%(W/V) BSA Flcoll 400 5 g PoLyvlnylpyrrolldone 5 g BSA 5 g 以 切断 DNA。 5.加入 2 倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。 6.离心回收 DNA 后，溶解于 100 ml 的去离子水中。测定溶液的 OD260值。 7.计算溶液的 DNA 浓度后，稀释 DNA 溶液至 10 mg/ml。 8.煮沸 10min 后，分装成小份 (1 ml/份 )。 -20 保存。 9.使

13、用前在沸水浴中加热 5min 后，迅速冰浴冷却。 DNA 变性缓冲液 组份浓度 1.5 M NaCl， 0.5 M NaOH 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于 l L 烧杯中。 NaCl 87.7 g NaOH 20 g 2.向烧杯中加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至 l L 后，室温保存。 预杂交液 /杂交液 (DNA 杂交用 ) 组份浓 度 配制置 100 ml 配制方法 1.称量下列试剂，置于 200 ml 烧杯中。 2.充分混匀后，使用 0.45 m 滤膜滤去杂质后使用。 预杂交液 /杂交液 (RNA 杂交用 ) 组份浓度 配制

14、量 100 mL 配制方法 1.称量下列试剂，置于 200 ml 烧杯中。 6 SSC(或 SSPE) 5 Denhardts 0.5%(W/V) SDS 100 g/ml Salmon DNA 20SSC(或 SSPE) 30 ml 50Denhardts 10 ml 10% SDS 5 ml 10 mg/ml Salmon DNA 1 ml dH2O 54 ml 6 SSC(或 SSPE) 5 Denhardts 0.5%(W/V) SDS 100 g/ml Salmon DNA 50%(V/V) Formamlde 2.充分混匀后，使用 0.45m滤膜滤去杂质后使用。 膜转移缓冲液 (W

15、estern 杂交用 ) 组份浓度 39 mM Glycine， 48 mM Tris， 0.037%(W/V)SDS， 20%(V/V)甲醇 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于 l L 烧杯中。 Glycine 2.9 g Tris 5.8 g SDS 0.37 g 2.向烧杯中加入约 600 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定溶至 800 ml 后，加入 200 ml 的甲醇。 4.室温保存。 TBST Buffer(Western 杂交膜清洗液 ) 组份浓度 20 mM Tris-HCl， 150 mM NaCl， 0.05%(V/V)Tween 20

16、 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于 l L 烧杯中。 NaCl 8.8 g 1 M Tris-HCl(pH8.0) 20 ml 2.向烧杯中加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加入 0.5 ml Tween 20 后充分混匀。 4.加去离子水将溶液定容至 l L 后， 4 保存。 封闭缓冲液 (Western 杂交用 ) 组份浓度 5%(W/V)脱脂奶粉 /TBST Buffer 配制量 100 ml 配制方法 1.称 5 g 脱脂奶粉加入到 100 ml TBST Buffer 中 ，充分搅拌溶解。 2.4 保存待用 (本封闭液应该现配现用 )。 五、 实验

17、室常用培养基的配制方法 Ampicillin(氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 组份浓度 100 mg/ml Ampicillin 配制量 50 ml 配制方法 1.称量 5 g Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 。 2.加入 40 ml 灭菌水，充分混合溶解后，定容至 50 ml。 3.用 0.22 m过滤膜过滤除菌。 20SSC(或 SSPE) 30 ml 50Denhardts 10 ml 10% SDS 5 ml 10 mg/ml Salmon DNA 1 ml Formamide(甲酰胺 ) 50 ml dH2O 4 ml 4.小份分装 (1 ml/份 )后， -

18、20 保存。 IPTG(异丙基 - -D-硫代半乳糖苷 )(24 mg/ml) 组份浓度 24 mg/mL IPTG 配制量 50 mL 配制方法 1.称 1.2 g IPTG 置于 50 ml 离心管中。 2.加入 40 ml 灭菌水，充分混合溶解后，定容至 50 ml。 3.用 0 22 m过滤膜过滤除菌。 4 小份分装 (1 ml，份 )后， -20 保存。 X-Gal (20 mg/ml) 组份浓度 20 mg/ml X-Gal 配制量 50 ml 配制方法 1.称量 l g X-Gal 置于 50 ml 离心管中。 2.加入 40 ml DMF(二甲基甲酰胺 )，充分混合溶解后，定容

19、至 50 ml。 3.小份分装 (1 ml/份 )后， -20 避光保存。 LB 培养基 组份浓度 1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨 )， 0.5%(W/V)Yeast Extract(酵母提取物 )， 1%(W/V)NaCl 配制量 1 L 配制方法 1.称取下列试剂，置于 l L 烧杯中。 Tryptone 10 g Yeast Extract 5 g NaCl 10 g 2.加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加 5 N NaOH(约 0.2 m1)，调节 pH 值至 7.0。 4.加去离子水将培养基定容至 1 L。 5 高温高压灭菌后， 4。 C 保存。 L

20、B/Amp 培养基 组份浓度 1%(W/V) Tryptone 0.5%(W/V) Yeast Extract 1%(W/V) NaCl 0.1 mg/ml Ampicillin 配制量 1 L 配制方法 1.称取下列试剂，置于 l L 烧杯中。 Tryptone 10 g Yeast Extract 5 g NaCl 10 g 2.加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加 5 N NaOH(约 0.2 mL)。调节 pH 值至 7.0。 4.加去离子水将培养基定容至 1 L。 5.高温高压灭菌后，冷却至室温。 6.加入 1 ml Ampicillin(100 mg/ml)后

21、均匀混合。 7.4 保存。 TB 培养基 组份浓度 配制量 1.L 配制方法 1.配制磷酸盐缓；中液 (0.17 M KH2PO4， 0.72 M K2HPO4)100 ml。 溶解 2.31 g KH2PO4和 l2.54 g K2HPO4于 90 ml 的去离子水中，搅拌溶解 后，加去离子水定容至 100 ml，高温高压灭菌。 2.称取下列试剂，置于 l L 烧杯中。 Tryptone 12 g Yeast Extract 24 g Glycerol 4 m 3.加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 4.加去离子水将培养基定容至 1 L 后，高温高压灭菌。 5.待溶液冷却至 6

22、0 以下时，；加入 100 ml 的上述灭菌磷酸盐缓冲液。 6.4 保存。 TB/Amp 培养基 组份浓度 1.2%(W/V) Tryptone 2.4%(W/V) Yeast Extract 0.4%(V/V) Glycerol 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4 0.1 mg/ml Ampicillin 配制量 1 L 配制方法 1.配制磷酸盐缓冲液 (0.17 M KH2PO4， 0.72 M K2HPO4)100 ml。 溶解 2.31 g KH2PO4,和 12.54g K2HPO4于 90 ml 的去离子水中，搅拌溶解后，加去离子水定容至 100 ml，高温高压灭菌

23、。 2.称取下列试剂，置于 l L 烧杯中。 Tryptone 12 g Yeast Extract 24 g 1.2%(W/V) Tryptone 2.4%(W/V) Yeast Extract 0.4%(V/V) Glycerol 17mM KH2PO4 72mM K2HPOa Glycerol 4 ml 3.加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 4.加去离子水将培养基定容至 l L 后，高温高压灭菌。 5.待溶液冷却至 60 以下时， 加入 100 ml 的上述灭菌磷酸盐缓冲液 。 6.均匀混合后 4 保存。 SOB 培养基 组份浓度 2%(W/V) Tryptone 0.5

24、%(W/V) Yeast Extract 0.05%(W/V) NaCl 2.5mM KCl 10 mM MgCl2 配制量 1 L 配制方法 1.配制 250 mM KCl 溶液。 在 90 ml 的去离子水中溶解 l.86 g KCl 后，定容至 100 ml。 2.配制 2 M MgCl2溶液。 在 90 ml 去离子水中溶解 19 g MgCl2后，定容至 100 ml，高温高压灭菌。 3.称取下列试剂，置于 l L 烧杯中。 Tryptone 20 g Yeast Extract 5 g NaCl 0.5 g 4.加入约 800 ml 的去 离子水，充分搅拌溶解。 5.量取 10 m

25、1 250 mM KCl 溶液，加入到烧杯中。 6.滴加 5 N NaOH 溶液 (约 0.2 m1)，调节 pH 值至 7.0。 7.加入去离子水将培养基定容至 l L。 8.高温高压灭菌后， 4 保存。 9.使用前加入 5 ml 灭菌的 2 M MgCl2溶液。 SOC 培养基 组份浓度 2%(W/V) Tryptone 0.5%(W/V) Yeast Extract 0.05%(W/V) NaCl 2.5 mM KCl 10 mM MgCl2 20 mM Glucose 配制量 100 mL 配制方法 1.配制 l M Glucose 溶液。 将 18 g Glucose 溶于 90 m

26、l 去离子水中，充分溶解后定容至 100 ml。用 0.22 m滤膜过滤除菌。 2.向 l 00 ml SOB 培养基中加入除菌的 1 M Glucose 溶液 2 ml，均匀混合。 3.4 保存。 2YT 培养基 组份浓度 1.6%(WV)Tryptone， 1%(W/V)Yeast Extract， 0.5%(W/V)NaCl 配制量 1 L 配制方法 1.称取下列试剂，置于 l L 烧杯中。 Tryptone 16 g Yeast Extract 10 g NaCl 5 g 2.加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加 5 N NaOH，调节 pH 值至 7.0。 4.

27、加去离子水将培养基定容至 1 L。 5.高温高压灭菌后， 4 保存。 bbroth 组 份 浓 度 2%(W/V)Tryptone ， 0.5%(W/V)Yeast Extract ， o 5%(W/V)MgSO47H2O 配制量 1 L 配制方法 1.称取下列试剂，置于 l L 烧杯中。 Tryptone 20 g Yeast Extract 5 g MgSO47H2O 5 g 2.加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加 1 N KOH。调节 pH 值至 7.5。 4.加去离子水将培养基定容至 1 L。 5.高温高压灭菌后， 4 保存。 NZCYM 培养基 组份浓度 0.5%(WV) Yeast Extract 0.1%(WV) Casamino Acid（ 酪蛋白氨基酸 ） 1%(WV) NZ 胺 0.5%(WV) NaCl 0.2%(WV) MgSO47HO 配制量 1 L 配制方法 1.称取下列试剂。置于 l L 烧杯中。 Yeast Extract 5 g Casamino Acid 1 g NZ 胺 10 g