1、 药品生产质量管理工程 学院：化学科学与工程学院 专业：无机化学 姓名：袁晓红 学号： 12014001074 高效液相色谱仪（ HPLC）的验收、使用及维护 摘要： 高效液相色谱仪在许多领域应用日益广 泛，又因为它主要靠进口，价格比较昂贵，所以它的使用和维护显得十分重要。本文阐述了从购买到安装、检测高效液相色谱仪的操作步骤及高效液相色谱仪的系统组成、各部件的功能和工作原理以及在使用过程中应注意的问题，注意维护从而达到节约仪器耗材、延长仪器使用寿命的目的。 关键词： 高效液相色谱仪；验收；使用；维护 高效液相色谱仪它是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术而发展起来的。在高效液相色谱
2、中，流动相与组分之间有一定的亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固 定相的性质，还与流动相的性质密切相关，一般情况下，高效液相色谱仪的分析可在室温下进行，由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相黏度高，因此必须采用高入口压，以此来维持一定的流动相线速。高效液相色谱仪对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的物质特别有利，它在医药、生化等方面具有非常重要的作用。 1.高效液相色谱仪的结构和原理 高效液相色谱仪主要贮液器、脱气器、高压泵、进样器、色谱柱和检测器等组成。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论。在技术上，流动相改
3、为高压输送：色谱柱是以特殊的方 法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱；同时连接有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续精确地检测。 其工作原理如下：首先储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在流动相和固定相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附一解吸的分配过程，各组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而，按先后不同顺序从固定相中流出，通过检测器时，样品浓度被转换成信号传送到记录仪，数据通过以谱图等形式记录下来。 2.高效液相色谱仪的 验收 仪器验收是一项很细致的工作。仪器验收的目的是检查
4、外商提供的商品是否达到了它的性能指标。一台高效液相色谱仪到货后 ， 首先要组织一个精悍的验收小组 ， 由液相色谱专家、应用技术人员、电气技术人员和器材部门的代表组成。应准备专用的记录本、详细记载验收过程中的原始记录。整过程分数量验收、外观检查和质量验收三步。 即首先俭查货物装箱单上所开列的物件与原订货合同是否相符、核对无误后对主机和各零部件进行外观检查 ， 仪器经过长途运输和装卸、难免有叩碰、如果防震、耐压的包装完善的话、是可以完好无损地到达用户手 中的。若发现包装破损就要注意仪器有否受损 ， 特别对那些精密光学部件和光源有否发生位移和破碎。仪器如无缺损、外观完好、则在仔细阅读使用说明书后即可
5、开始质量 (或性能 )验收的工作。 高效液相色谱仪的主要部件有高压泵、进样阀、色谱柱、检测器、记录器和梯度装置等。先进行单机检查、然后再联机测试单机检查是指脱开其他连接部件、单独对某一组件进行检查。然后对整个系统联机测试。 2.1 高压输液泵 主要检查其压力和流量能否达到规定的指标。例如 ， 指标规定该高压泵可达最高压力 500 公斤 /厘米 2“则在泵出口处接一堵头 ， 观察泵压是否可达 500 公斤/厘米 2“ ， 系统的所有接头处有否渗漏象 ， 泵密封垫圈是否可靠地工作。目前 .高压泵的流量范围一般为 0.05 -9.9 毫升 / 分 ， 须检查流量精密度和重复性。流量精密度是指在设定流
6、量条件下与实测流量是否相符 ， 方法是用精密量筒和停表测定单位时间的流量 ， 一般 ， 在最低或最高流量条件下客易偏离原设定流量。所谓重复性是指在不同情况下 (如空载和不同柱压降 )流量的变动。这里要注意的是大多数泵的压力、流量指标分两档 ， 即流量 5 毫升 /分以下最高压力为 500 公斤 /厘米 2， 0.05 一 9.9 毫升 /分的最高压力为 250 公斤 /厘米 2， 不能要求在高流量条件下达到最高压力。 2.2 检测器 2.22 紫外吸收检测器 包括单波长和可变波长两类。需要检查以下几项 ， 噪音和漂移 将灵敏度放在最高档程 ， 分别在静态和动态条件下 ( 即没有或有流动相通过检
7、测池 ) 测定基线的噪音和漂移 （图 1） ， 并同指标比较。 稳定性 检测器连续工作 12 小时或 24 小时 ， 观察基线噪音和漂移的情况。 灵敏度自检 (以 LD C 公司 1203 单波长紫外检测器为例 ) 将档程 (RANGE) 放在 0.512 位置 ， 选择开并 (ZERO/CHE CK) ， 放在CH-ECK， 记录器应偏转满标的 50 %。换句话说 ， 从电气线路给出 0.268 土0.01AU 的偏转值 ， 看记录器指示是否相应偏转满标的 50 %。 动态线性范围 随着样品量的改变 ， 检测器有一个线性响应的范围 （图 2） 有的是 3 个数量级 ， 有的是 4 个数量级。
8、 波长精度测定 各种可变波长检测器有不同的检查方法。例如日立 200-10 型分光检测器利用氖灯在 656.1nm 光谱线检测。从 658nm 开始慢慢向短长扫描 ， 记录仪应在656.1 土 0.4nm 范围获得最大读数 ， 如能重复几次即可视为达到了指标要求。 2.23 杀差折光检 测 器 有两种。一种是反射式示差折光检测器 (例如 LDC 公司生产的 )， 有两个棱镜 (折光指数为 1.31-1.45 和 1.40-1.55)， 根据所用溶剂和被测样品的折光指数的范围来选择。 使用前先要调整跟踪 (Track )， 否则基线无法归零 ， 并有显著的漂移和噪音。跟踪调整方法可参阅说明书。
9、基线噪音和漂移 示差折光检测器易受温度的影响 ， 漂移可能会较大 ， 可按指标要求检查。 跨导 (Spa n) 调整 用来准确刻度示差折光单位 (RIU)， 以便在记录仪上可直接读出 RIU。 方法如下 ： 溶解 13.33 克干燥过的蔗糖于 10 毫升蒸馏水中。再取出 5 毫升稀释至 1 升。该溶液应为 10-4IRU。将该溶液注入样品池。测量档程放在 16位置。记录仪应偏移至满标的 62.5%， 如不够或超过均可调 SPan 电位器至该偏转位置。 另一种是偏转型示差折光检测器 ， 范围较宽 ， 可测折光指数 1-1.75， 例如日本昭和电工生产的 Shodex RI， SE-51， 其跨导
10、调整稍有不同 ， 方法如下 ， 溶解220 毫克蔗糖于 10 毫升脱气蒸馏水中 ， 该溶液的折光指数同蒸馏水折光指数之差应为 32 10-5RI U， 将该溶液注入样品池 ， 参比池保持蒸馏水 ， 测量挡程放在32位置 ， 记录笔应偏移满标的 100%， 如不够 ， 可调机 ， 体内的 SPa n 电位器 。 动态线性范围和最小检测量并无固定指标可视需要测定。 2.24 荧光检 测 器 目前多数是光栅自动扫描荧光检测器 ， 其激发波长和发射波长范围为220-780nm， 检查光栅准确度 如果氨灯作光源 ， 样品池盛满馏水 ， 激发波长 (Excitaton Wavlength) 放在O 位置
11、， 发射波长 (Emission Wavelength ) 在 467nm 慢慢来回转动发射波长度盘 ，并注意指示表的读数在最大的位置 ， 此时发射波 长应在 467 土 5nm 为合适。 反 过 来 ， 发射波长放在 O 位置 ， 激发波长在 467nm 附近慢慢来回转动 ， 指示表在最大读数位置处 ， 激发波长应在 467 士 5nm。 检查已知样品的荧光光谱 用标准样品 蒽， 配置 0.01 微 /毫升的乙醇溶液 ， 激发波长放在 250nm，发射波长扫描图 3。 定量分析 配置不同浓度的硫酸奎宁 0.1 N 硫酸溶液 ， 在激发波长 365nm 和发射波长46onm 条件下 ， 作定量
12、工作曲线 （图 4) 检查检测器的线性响应。还可用 蒽 或丹酰 化氨基酸测定最小检测 。 2.3 进样阀 进口液相色谱仪都采用进样阀进样 ， 其工作压力多数在 150 公斤 /厘米 2， 所以 ， 若较长时间工作在 150 公斤 /厘米 2 以上极易损坏进样阀转子造成漏液。对进样阀主要检查两项指标 。 2.31 定量准确性 进样阀都有固定体积的定量管 (Loop)一般是 10 微升和 20 微升 ， 可用微量注射器精确测量定量管的体积。一次进样的绝对量是通过样品液的浓度乘上定量管体积得到的。 2.32 重复性 连续几次进样 ， 分别 测得检测器的响应值 ( 以峰高或峰面积表示 )， 可算出均方
13、偏差和变异系数。 2.4 色谱柱 色谱柱是液相色谱仪的重要组件 ， 在运输过程中由于振动或柱内溶剂挥发导致柱效下降、柱分离效能变差 ， 因此 ， 需要检查几个指标。 2.41 柱效 选择一个纯净的已知样品和合适的流动相 ， 得到样品的保留体积和半峰宽( 也可取峰底宽 )， 如每根柱子长度为 25 厘米 ， 则理论塔板高度 H=L/N 所以 H=250/7369 毫米 =0.034 毫米 各种柱子测柱效使用的已知样品和流动相各不一样，如 C1 8 反相柱可用作萘已知样品 75 %甲醇 25%水为流动相。 2.42 峰不对称性 由峰尖作垂线与底线相交，在峰高 10%处截取 A 和 B，然后计算峰对
14、称因子B/A，一般以 0.8-1.2 为宜。 2.5 记录仪 2.51 灵敏度 有 1.2.5.10.20.50.l00.500.l000 毫伏各挡，分别代表满标毫伏数。可用标准电子电位差计分别向记录仪输入上述各毫伏数，视记录笔是否满标偏移。 2.52 准确度 如指标规定为满标的 0.3%， 则向记录仪输入某一毫伏数几次 ， 观察满标响应值的偏差和重复性 。 2.53 记录纸速度 可设定某一记录纸速 ， 如 5 毫米 /分 ， 在一定时间内量取走纸长度 ， 与设定纸速比较。还可测定不同时间内记录纸速是否均衡。 2.6 梯度洗脱装置 一般 ， 由梯度程序装置控制 （ 图 6） ， 可作各种形式的
15、梯度洗脱曲线。但由于混合室以及连接管道等死体积的存在 ， 实际的梯度曲线 (即流动相组成的变化 )总要比理想的滞后一段时间 （图 7） ， 故应尽量减小死体积和提高溶剂混合的效率 。 3.高效液相色谱仪的实验室操作流程 3.1 开机步骤 （ 1） 打开计算机后自动弹开 菜单 通信成功。 （ 2） 打开色谱仪开关，进入在线工作站。 （ 3） 预热 30 min 即可 （ 4） 设置泵 （ 5） 排气泡 （ 6） 编辑检测方法 （ 7） 参数设定 （ 8） 基线调节 （ 9） 样品信息 （ 10） 开始进样 （ 11） 停止采样 （ 12） 峰优化 （ 13） 打印报告 3.2 关机步骤 将手动进样器扳手扳上去，拔出进样器 (自动进样器除外 )；停止检器和泵，退出色谱工作站；关闭液相色谱仪电源，关闭计算机。 4.高效液相色谱柱的正确使用 4.1 加装保护柱 保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、进样阀后部以及在色谱柱的两端都装有 1、 2 m 等不同孔径的滤器，但滤器只能除去不溶性颗 粒而不能除去化学污然，因此，加装保护柱是必要的，特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样品时更是保护分析柱必不可少的措施。保护柱填料应与分析柱一致，粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品，经过一定次数的样品分析
