1、发酵工程,. 前言. 概况. 微生物发酵过程. 典型产品的发酵生产,发 酵 工 程Fermentation Engineering,发酵工程,发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。,将微生物学，生物化学和化学
2、工程的基本原理有机地结合起来，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。以培养微生物为主，所以又称微生物工程。,发酵工程,前言,生物技术的多学科性示意图,前言,发酵工程、遗传工程、细胞工程和酶工程构成了生物工程的四大支柱。无论从微生物得到酶或用遗传工程菌获得产品，都必须依赖发酵工程技术。发酵工程的主体是微生物，特别是用经过DNA重组技术改造过的微生物。,发酵工程,前言,时间 发酵阶段 主要产品 主要技术 -1900 天然发酵 酒、醋、干酪、酵母 天然分批 1905- 纯培养 酒精、丙酮、丁醇 密闭纯培养 1940- 通气
3、搅拌 抗生素、有机酸 通气搅拌 酶 、维生素 分批或连续 1957- 代谢控制 氨基酸、核苷酸 选育缺陷菌株 1960- 开拓原料 单细胞蛋白 连续发酵 1979- 基因工程菌 胰岛素、干扰素 DNA 重组,工业发酵的发展简史,生产菌种的选育发酵条件的优化与控制反应器的设计产物的分离、提取与精制,概况,发酵工程的内容,Fermentation engineering,上游工程UPSTREAM PROCESSES,下游工程DOWNSTREAM PROCESSES,发酵工程组成从广义上讲，由三部分组成： 上游工程、发酵工程、下游工程,UPSTREAM PROCESSES- genetics, ce
4、ll - inoculum development media formulation sterilization- inoculation,上游工程,Fermentation engineering,DOWNSTREAM PROCESSES- product extraction, purification & assay- waste treatmentby product recovery,下游工程,Fermentation engineering,发酵的定义,1、传统发酵2、生化和生理学意义的发酵3、工业上的发酵,概况,传统发酵,描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的
5、生产过程。,概况,生化和生理学意义的发酵,指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，即以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。,工业上的发酵,泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程包括：,概况,厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨 基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。,发酵工业,指利用生物的生命活动产生的酶，进行无机或有机原料的酶加工，获得产品的工业。,概况,微生物菌体发酵,概况,发酵类型,以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。,面包酵母发酵单细胞蛋白发酵,药用真
6、菌名贵中药微生物杀虫剂疫苗,传统的菌体发酵,新的菌体发酵,微生物菌体发酵特点,细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。,发酵类型,微生物酶发酵,发酵类型,酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。分类：胞内酶和胞外酶。生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。,微生物代谢产物发酵,包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所积累
7、的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。,发酵类型,微生物的转化发酵,利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。,例如：乙醇 乙酸,葡萄糖 葡萄糖酸,发酵类型,生物工程细胞的发酵,发酵类型,利用生物工程技术所获得的细胞，如工程菌以及“杂交”细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。,发酵生产生长激素的“工程菌”,微生物特殊机能的利用,发酵类型,利用微生物消除环境污染利用微生物发酵保持生态平衡微生物湿法冶金利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域,发酵技术的应用,产物：微生物
8、细胞，酶，活性物质，特殊化学品和食品添加剂。,发酵过程中的上、中、下游过程,上游加工-最重要的是提供和制备高产优质和足够数量的生物催化剂。即应用常规选育、基因工程、细胞工程和酶工程手段获得优良菌株、细胞系或固定化的菌体等。下游加工-从反应液中提取目的产物 加工精制成合格产品，废物处理。中游加工-生物反应器为中心。,发酵工业简介发酵食品有机酸氨基酸核酸类物质酶制剂医药工业（抗生素）饲料工业（单细胞蛋白环境工程（废物处理）其它 （冶金工业）,Fermentation Industry Fermented FoodsOrganic AcidsAmino AcidsNucleotidesEnzymes
9、 Pharmaceutical (Antibiotics)Feedstuff (eg. SCP)Environmental Application (Waste Treatment)Others (eg. Metallurgical industry),发 酵 过 程,即微生物反应过程，指由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应的过程。根据对氧的需要分：厌氧和有氧发酵。根据培养基物理性状分：液体和固体发酵。根据微生物生长特性分：分批发酵和连续发酵。,发酵工程,发酵工业中的微生物,一.细菌（Bacterium) 形态,球形,杆形,弧形螺旋形,微生物种类,各种“视野”下的细菌,光镜,暗视野,荧光,
10、透射电镜,超薄切片,冷冻切片,扫描电镜,DNA蛋白质复合物,结 构,基本结构:细胞壁；细胞膜；细胞质；类核(染色体)。,特殊结构:荚膜；芽孢；鞭毛；质粒。,微生物种类,染色体,质粒,培 养 特 征,固体培养基上:菌落（colony）：指单个微生物或一小堆同种细胞在适宜条件下，在固体培养基表面形成的肉眼可见的以母细胞为中心的子细胞集团。若来自一个细胞，则为纯培养菌苔(lawn)：大量细菌的菌落连成一片。,微生物种类,液体培养基上 均匀混浊； 沉淀生长； 表面生长。,培 养 特 征,微生物种类,用于淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸、肌苷的生产。,二. 放线菌(Actinomycetes),微生物种类,用
11、于链霉素、红霉素、庆大霉素、金霉素等的生产。,三.酵母菌(Yeast),微生物种类,用于酿酒、制造面包、脂肪酶、药用和饲料用菌体蛋白的生产。,四.霉菌（Mold),曲霉,微生物种类,菌落特征 形态较大，疏松，外观干燥不透明，呈现蛛网状、绒毛状、棉絮状；与培养基连接紧密，不易挑取，正反面、边缘与中心颜色常不一致。,微生物种类,霉菌的作用,糖化和蛋白质水解。,传统发酵：酱油、豆腐乳、酿酒。现代工业：酒精、有机酸（柠檬酸、乳酸）、抗菌素（青霉素、灰黄霉素）、植物生长激素（赤霉素）、杀虫农药（白僵菌剂）、酶制剂（糖化酶、蛋白酶、纤维素霉、果胶酶）。,五.担子菌（菇类）,微生物种类,用于多糖、橡胶物质、
12、抗癌药物的开发。,六.藻类,微生物种类,螺旋藻是一种生长在碱性盐湖的蓝绿藻植物，是一种微型螺旋状海藻，营养极其丰富，含蛋白质高达60-70%,是牛肉的3倍，猪肝的4倍，鸡蛋的6倍，大米的10倍，其中8种是人体必需又不能自行合成的。含有VA、B1、B2、B6、B12、E、PP、K、泛酸、叶酸等多种维生素，几乎所有的维生素都可以在螺旋藻中找到。VB12含量最高，比猪肝高3倍，可以纠正恶性贫血。,螺旋藻,微生物种类,从螺旋藻中提取的螺旋藻多糖是高纯度生物活性物质，含有免疫多糖、活性肽、多种氨基酸、维生素和微量元素，是最强免疫增强剂之一，它通过激活体细胞、免疫细胞和体液免疫系统增强抗病毒、抗肿瘤、抗细
13、菌感染能力，间接地抑制病毒、癌细胞和细菌生长，对正常人体细胞无伤害，是化疗放疗的有效辅助药物。,发酵的一般过程,发酵过程,发酵过程,菌种,选育 目的是改善菌种的特性，使能提高产量、改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。 基本方法 自然选育、生产育种、抗噬菌体菌株的选育、诱变育种、代谢控制育种及原生质体技术和体外重组DNA技术（基因工程）等。,发酵过程,地点方法,目的方法,方法,方法,菌种,发酵过程,种子罐级数,指种子需逐级扩大培养的次数。一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快的细菌，种子用量少，故种子罐级数相应也少。如谷氨酸生产，种子接入
14、种子罐后于320C培养7-10h，菌浓达到108-109个/ml，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，种子接入一级种子罐27C培养40h后，再需移入装有新鲜培养基的第二级种子罐，于270C培养10-24h移至发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。,发酵过程,发酵过程,种子扩大培养流程图,生理代谢菌种筛选,种子培养,发酵培养,发酵,发酵步骤和工艺流程,用作菌种培养及扩大生产的发酵罐培养基的配制培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中将发酵罐中的
15、菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物,发酵过程,下游处理,将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品。回收或处理发酵过程中产生的废物和废水。获得的产物按照有关部门制定的国家标准进行质量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品。,发酵过程,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐试验,发酵工业的意义与展望,利用遗传工程等先进技术，人工选育和改良菌种采用发酵技术进行高等动动植物细胞培养固定化技术广泛应用开发和采用大型节能高效的发酵装置，自动控制将成为发酵生产控制的主要手段应用代谢控制技术，发酵生产氨基酸、抗生素、维生素将生物技术广泛地用于环境工程,氨基酸（Glu）生产方法,发酵法 是氨基酸生产的主要方法，目前用发酵
16、法生产的氨基酸已有20多种。 酶法 利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。提取法 蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。合成法 DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。,谷氨酸生产,谷氨酸发酵,谷氨酸生产,谷氨酸（-氨基戊二酸）,谷氨酸的生物合成TCA循环-酮戊二酸 谷氨酸 Glu脱氢酶 COOH COOH C=O Glu脱氢酶 CHNH2 CH2 +NH4+ +NADPH2 CH2 +H2O+NADP CH2 CH2 COOH COOH,谷氨酸生产,Glu发酵生产的菌种,棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属，革兰氏阳性不形成芽胞没有鞭毛，不能运动需要生物素作为生长因
17、子在通气条件下才能产生谷氨酸。,发酵工程应用,Glu发酵生产的原料制备,酸水解调浆：干淀粉用水调成10-11Bx的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8至pH1.5。糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80下中和。中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0脱色：粉末状活性炭脱色，用量为0.6-0.8，在60及酸性条件下搅拌后过滤。,发酵工程应用,淀粉水解糖的制备,酶水解以大米或碎米为原料大米浸泡磨浆，调成15Bx，调pH6.0， 85 加细菌a-淀粉酶液化30min， 60 加糖化酶糖化24h，过滤，即得淀粉水解液。,淀粉水解糖的制备,发酵工程应用,发酵工程应用,菌种扩大培养,一级种子培养：由葡萄糖、玉
18、米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32 培养12h。二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 通气搅拌7-10h。活菌数为108-109 /ml。,谷氨酸发酵,适应期：菌体生长迟缓，糖不利用，约2-4h。可采取增大接种量和控制发酵条件使该期缩短。对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。菌体生长迅速，不产酸，约12h。需及时供给菌体生长必须的氮源（尿素）及维持pH在7.5-8.0，保温在30- 32停止期（谷氨酸合成期）及时流加尿素提供氨以维持pH7.
19、2-7.4。大量通气，控制温度34-37 。发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。当营养物耗尽、Glu浓度不增加时，及时放罐。发酵周期一般为30h,发酵工程应用,谷氨酸的提取,发酵工程应用,等电点法：pI=3.22，发酵液 pH 调到等电点，使Glu沉淀。离子交换法：在pH3.22时， Glu带正电，用强酸型阳离子树脂（732）氢型吸附后， 在60C用4% 的NaOH洗脱， 洗脱液返回等电法提取 。,谷氨酸溶于水 活性炭脱色 加Na2CO3中和 谷氨酸单钠（味精粗品） 除铁 压滤 活性炭脱色 压滤 减压浓缩 结晶 离心分离 干燥 成品,味精制造,发酵工程应用,结 束,作业,一. 术语解释 发酵、发酵工程、初级代谢产物、次级代谢 产物、生物工程细胞发酵、下游加工.二. 思考题 1、p120：1 2、简述谷氨酸的生产工艺。,
