1、实 验 生 物 学,重组DNA技术与基因工程,华东理工大学 张惠展,重组DNA技术与基因工程,5,2,3,4,1,6,重组DNA技术与基因工程的基本概念,重组DNA技术所需的基本条件,重组DNA技术的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在酵母中的表达,A 重组DNA技术与基因工程概念辨析,1 重组DNA技术与基因工程的基本概念,重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技
2、术的三大基本元,重组DNA技术的定义,件。,A 重组DNA技术与基因工程概念辨析,1 重组DNA技术与基因工程的基本概念,基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞大规模培养、基因产物分离纯化、生物产品制造过程的工程化,基因工程的定义,（本讲座侧重于上游技术）。,B 重组DNA技术与基因工程的基本用途,1 重组DNA技术与基因工程的基本概念,分离、扩增、鉴定、研究、整理基因信息资源,规模化生产生物活性物质,设计、构建生物的新性状甚至新物种,分离、扩增、鉴
3、定、研究、整理基因信息资源,从染色体DNA上定向分离目的基因,将获得的目的基因扩增至足够数量,采取加减法策略鉴定基因生物功能,gain of function,loss of function,通过序列缺失研究基因内的功能域,根据同源基因序列整理生物进化树,GGTATCGTCATCTACTACGTGGCAAT,酶,生物分子产品,干细胞,工程干细胞,组织器官,分离工程,组织工程,组织器官,生物分子产品,发酵工程,细胞工程,代谢工程,分离工程,分离工程,酶工程,采集 / 培养,基因工程,蛋白质工程,途径工程,组织工程,基因工程,规模化生产生物活性物质,设计构建生物的新性状甚至新物种,突变细胞,基因
4、敲除,野生细胞,野生动物,基因敲除,突变动物,天然物质或合成物质,高通量筛选,基因导入,基因导入,C 基因工程的基本形式,1 重组DNA技术与基因工程的基本概念,第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程,第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程,第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 代谢途径工程,第四代基因工程 全基因组或染色体的操作 基因组工程,切,接,转,增,检,第一代基因工程：蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程,第二代基因工程：突变蛋白和融合蛋白定制 蛋白质工程,天然蛋白质编码序列,蛋白质功能域编码序列,突变蛋白,融合蛋白,第二代基因工程：全新蛋白设计 蛋白质工
5、程,天然存在蛋白,定向进化蛋白,全新设计蛋白,序列理论可能性20200种,天然存在序列1012种,Nature 537 2016,P,P,P,P,P,GDP,GTP,P,P,FGF,质膜,核膜,FGFR,FRS,Grb2,SOS,Ras,Raf,MEK,MAPK,TF,A,B,C,D,E,F,G,信号转导途径的遗传操作,物质代谢途径的遗传操作,单基因操作,多基因操作,强化表达 / 导入基因,衰减表达 / 敲除基因,定点突变 / 基因洗牌,多单链片段重组,多模件重组,转录机器全局工程,基因回路,基因回路,第三代基因工程：代谢信息途径的修饰重构 途径工程,（合成生物学）,第四代基因工程：基因组工程
6、,N. Annaluru et al. Science 344, 55, 2014,以野生型酿酒酵母第III号染色体的317kb序列为蓝本，作者设计并合成了一个273 kb长的功能性染色体模仿物synIII。改造内容包括：终止密码子的置换；亚端粒区、内含子、tRNA基因、转座子、交配位点a的删除及96个loxP元件的插入。这条人工设计和改造的染色体对细胞生长无损害，且表,现出多代遗传稳定性。,J.C.Venter et al. Science 351, 1414, 2016,将化学合成的蕈状支原体基因组克隆在酵母中，经甲基化修饰后移植到山羊支原体受体细胞中。,第四代基因工程：全基因组的克隆与编
7、辑 基因组工程,由此生成了一个基因组最小化的蕈状支原体化学合成型活性细胞JCVI-syn3.0，仅含473个基因，但生长速度降低两倍。,第四代基因工程：基因组工程 全基因组定点编辑,基因组工程的另一项最新进展是利用CRISPR-Cas9系统在哺乳动物活细胞内对基因组上的各基因进行定向敲除，并由此建立起基因与表型之间的因果关联。在该系统中，细菌来源的核酸内切酶Cas9能在短小单链RNA（sgRNA）的指导下，序列特异性地定位并作用于复杂基因组上，从而实现对哺乳动物大型基因组各区域的功能查询。T. Wang et al. Science 343, 80, 2014；O. Shalem et al.
8、 Science 343, 84, 2014,D 基因工程的基本原理,1 重组DNA技术与基因工程的基本概念,提高外源基因的剂量：分子遗传学原理,筛选修饰重组基因表达的转录调控元件：分子生物学原理,如：启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等,如：SD序列、mRNA非编码区、密码子、polyA位点等,修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件：分子生物学原理,工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产：生化工程学原理,E 重组DNA与基因工程的支撑技术,1 重组DNA技术与基因工程的基本概念,核酸凝胶电泳技术,核酸分子杂交技术,细菌转化转染技术,DNA序列分析技术,寡核苷酸合成技术,基因定点突变技术,聚合酶链反应技术,C 基因工程的基本形式,1 重组DNA技术与基因工程的基本概念,B 重组DNA技术与基因工程的基本用途,A 重组DNA技术与基因工程的概念辨析,D 基因工程的基本原理,E 重组DNA与基因工程的支撑技术,
