1、DIG 检测试剂盒疑难问题及解决方案一、灵敏度低或信号弱的问题及解决方案？1. 探针标记效率低：2. 膜的问题：使用阳性尼龙膜3. 杂交：增加标记探针的浓度，或减少洗涤时的严谨性4. 曝光时间：增加曝光时间；使用高灵敏度的专用化学发光的 Lumi-Film 胶片，其他像 Kodak XAR 也可。二、高背景解决方案?1. 探针标记：纯化的 DNA 或 RNA 在标记前用乙醇沉淀；确认探针对靶序列是特异性并跟其他载体无同源性；2. 膜：推荐使用罗氏或经过验证的膜(pall)、Ambion 膜3. 杂交：使用 CDP-Star 发光底物，最好将 DIG 探针浓度稀释到（RNA 20-50ng/ml
2、）另外在杂交过程中不要让膜干燥4. 检测过程：将抗 DIG-AP 的酶的浓度到由原来的 1:20,000 减少到 1:50,000，也不会减少酶检测的灵敏度。增加洗脱和封闭的溶液的量和次数；膜上出现斑点可能是由于酶在膜上的凝集，需要将膜短暂离心后使用。5. 曝光时间：缩短曝光时间，通常为 15-60s。Ambion 生物素化探针疑难问题解决方案一、探针类型、设计及标记方法（一）探针类型如何选择？1.单链 DNA 探针：对于传统的杂交缓冲液，单链探针的效果要好于双链探针，因为双链探针可与未标记的 RNA 结合，降低了探针与靶 RNA 结合的浓度，使杂交信号减少，另外双链探针之间可以退火，降低探针
3、的浓度。1) 引物延伸法：质粒克隆或 PCR 产生的模板2) 非对称扩增 PCR:3) 末端标记的寡核苷酸；优点:简单、经济，对于同源性较高的序列或对靶基因序列了解较少情况下适用。通常在 5末端用多聚核苷酸激酶标记，但每一个分子仅有一个可标记的基团，比内部掺入标记的探针灵敏度更低，且杂交温度需要去摸索。2.双链 DNA 探针：有高度特异性，能用于随机引物进行标签，快速和可靠。缺点是; 在杂交前需要变性。3.RNA 探针：质粒克隆表达或 PCR 产生的 DNA 模板进行体外转录合成 RNA 探针。（二）探针设计原则;1.探针需在反义链上：才能跟 mRNA 互补,启动子应在 3末端编码区 。双链
4、RNA 探针需含有意义链和反义链。合成单链探针时要考虑合成的是反义 RNA，启动子应在 3末端。下图示意选择启动子的位置; 在反义链 3端使用启动子 1 产生的正义 RNA 探针，在反义链 5端使用启动子 2 产生的反义链 RNA 探针。2.探针长度：在 100-1000 之间，大于 1000 则产生高背景,很难区分异源序列。如果用随机引物标记，探针长度为模板长度的一半。如果模板长度少于 100，杂交温度和洗脱则按照寡核酸的条件进行。3.探针序列：探针应含有最少的非同源序列（如载体序列、内含子等） ，也应含有最少的同源序列。探针尽可能含有跟模板误配的碱基。4.标记：放射性或非放射性标记。5.寡
5、核苷酸探针：至少 15bp,但标记效率差，灵敏度低。每一个杂交分子只有一个标签分子。（三）探针制备方法1.随机引物标记法：通过切口平移或随机引物方法。质粒载体上的 DNA 或 CDNA 模板通过内切酶消化后再通过胶回收纯化。如果载体序列被标记了会产生高背景。这种方法要求模板的量不要过量，否则过量的模板会反过来与标记的模板竞争结合靶序列，减少了信号。2.体外转录法：质粒上的模板应该内切酶消化后，尽量避免过多的载体序列。单链 RNA 探针用DNA 酶消化后去除模板 DNA。3PCR 法：包括线性扩增和不对称 PCR。线性扩增 PCR 只使用单一引物，一定要去除未结合的核苷酸。不对称 PCR 可使用
6、上下游引物。但下游引物浓度更高有利于合成反义核苷酸。可使用 PCR 或反转录 PCR 为模板。4.引物延伸法：二、杂交温度的优化1.RAN 探针：在高温 68 ，高 AT 含量或与靶基因出现多个误配的探针，可能杂交失败。如果在此温度信号较弱，尽量减少杂交和洗脱温度至 60.2.DNA 探针：如果在 42 度有交叉反应(非特异性带) ，则增加温度到 45-48.3.寡核苷酸探针;有较低的 Tm 值，如果在 37杂交信号弱或无信号, 则用等量的 2.5SSC/7%SDS稀释杂交液,再回复到 37-42 杂交和洗脱。(二)条带高背景的原因1. 低于最适的杂交温度：如 DNA 探针温度为 42，RNA
7、 探针为 65，如低于此温度会出现高背景或交叉反应。杂交温度需凭经验来确定2. 探针浓度太高:如 RNA 探针浓度为 0.1nM ,DNA 化学标记法浓度为 1pM ，内部参入法为 10 pM，放射性标记为 106cpm/mL.使用更高浓度的探针，尽管克提高信号，但同时也增加了背景。3. 探针含有其他的序列(三) 条带及膜背景均高的原因1. 预杂交时间太短：低于 30min2. 暴露时间过长：化学显色法最佳的显色时间通常为 1-30 min.可以通过在不同时间、次数来得到最好的信噪比3. 探针中含有游离的核苷酸未能去除：未参入的游离核苷酸，可导致高背景4. 杂交缓冲液没有完全溶解：应将杂交液在
8、 68预热 15-30min,使之完全溶解。(四)跟条带不相关的高背景的原因1. 低质量的尼龙膜，不能使用 NC 膜2. 膜干燥：在预杂交到暴光的总过操作过程中，膜的干燥会导致高背景。3. 试剂在膜上没均匀分布：不要直接将探针加到膜上或预杂交缓冲液中，先用 1mL 杂交液稀释探针，再加进去。确保杂交液或洗涤液等能覆盖膜并能自由移动，最好温和震荡。如果 2 张以上膜在同一个容器中，确保不要粘在一起，并且不要有折叠、皱褶或气泡。4. 杂交缓冲液没完全溶解5. 微生物污染：当抑制剂感染真菌或细菌时，易出现此现象。6. 膜要保持干净：应用镊子夹在膜边沿，使用无粉的手套。7. 转膜之后或交联之前膜干燥：
9、可将膜浸在 1TBE8. 其他：1) 洗脱或封闭试剂含有盐和变性剂在室温出现沉淀，可以在 37-65预热溶解沉淀。2) 在膜上留有凝胶或丙烯酰胺残留物，可将膜在转移缓冲液中浸泡一下，或在洗脱阶段将时间由 5min 延长到 15min。3) 膜未能充分接触洗脱或封闭等试剂；推荐使用扁平的托盘如装 Tip 头的盖子，strep-AP 孵育后洗脱时间延长到 15min。4) 直接将 strep-AP 加到膜上：可导致高浓度的酶沉积到膜上产生高背景。通过将 strep-AP 与封闭剂充分混匀后再加入可避免高背景。推荐使用带刻度的离心管可上下颠倒用于稀释。5) 膜上过量的 CDP-Star 未吸干净：将
10、膜从托盘取出，置于滤纸上，用滤纸将膜印干去除多余的 CDP-Star。6) 塑料薄膜出现折叠或凹痕:最好使用单层薄膜。7) 滤纸应该充分浸泡使电流充分通过（五）信号弱或灵敏度低的原因;1.杂交温度不合适:DNA 探针在 42或 RNA 探针在 68 杂交。如果含有更高浓度的 GC 或 AT,探针跟靶基因会出现误配，杂交温度则凭经验。2.探针降解;特别是放射性探针易降解3.探针特异性太低：对于较短寡核甘酸探针，用末端标记，可选用更长的内部标记的探针。4.探针浓度太低：放射性探针（10 6cpm/mL） 、非放射性 DNA 探针(1PM), 非放射性 RNA 探针 0.1nm)5.操作问题：1)
11、双链探针不完全变性:2) RNA 转膜效率不高3) EB 染色不充分4) RNA 交联时间不够或太长5) 不能使用 NC 膜，使用带正电荷的尼龙膜6) 探针合成效率低：标记与未标记的探针 CTP 比率等于 2:37) 探针污染严重：OD260/280 应介于 1.8-2.16.暴露时间不够：低拷贝的 RNA 样品，等 CDP-STAR 2-4h 达到高峰后再曝光 30min-1h7.样品 RNA 太少:一般 10-20g。可以使用 mRNA(占总量的 0.5-3%)，还可使用更灵敏的技术如RT-PCR.8.含有太多的 rRNA: 靶 RNA 的电涌或电转可能被 rRNA 所抑制。（六）交叉反应
12、条带较多1. 探针浓度太高：非放射性标记的 RNA 探针 0.1nM,2. 杂交或洗脱条件不够严谨： DNA 探针温度为 42，RNA 探针为 68，低于此温度会导致非特异性条带。3. RNA 样品有多个靶序列：样品中跟探针有多个同源序列，因此重新进行探针设计时要尽量避免高同源序列区域；优化杂交温度和洗脱条件；减少探针浓度；使用双链探针能区分相似序列。4. 探针含有贪多的非同源序列：探针模板不纯，引物延伸和体外转录模板应在转录起始位点的下游，PCR 产生的探针应含有最少的内含子或非同源序列。（七）最佳洗涤条件的确定第二次洗涤的严谨性可通过改变温度来实现。典型的高严谨洗涤条件是 DNA 探针是
13、42，RNA 探针为 68，常低于 Tm 值 10-20。严谨洗涤的目的是去除误配到含有相似同源序列的探针，及结合到膜上的多余探针，而留下正确配对的探针-靶序列的二聚体。当杂交温度达到 Tm 值，杂交信号则会大量损失。高严谨洗涤会减少非特异性结合，(八)RNA 沉淀1.加 0.1V 的乙酸铵(终浓度为 0.5M)，涡旋混匀。对于低浓度的样品，可加沉淀剂糖原（10-20g/mL) 或线性的聚丙烯酰胺（10-20 g/mL)，要在乙醇添加之前加入。2.加 2.5V 体积的冰无水乙醇，再次混匀， -20放置至少 30min。3.4 12000rpm 15min，做好标记，沉淀 RNA，在背向轴中心的
14、离心管的后侧的底部形成可见的胶样沉淀。RNA 沉淀不会很紧的粘附在管底，因此要小心吸取上清液( 不要倾注法)，再见在室温短暂涡旋几秒以去除残余的乙醇液体，这种方式处理不需要在空气中干燥。RNA 储存：1) 长期储存：乙醇沉淀后置于-802) 甲酰胺保存：等体积加3) 0.1mM EDTA,TE，溶液中二价阳离子能催化 RNA 链的裂解，EDTA,TE 是螯合剂，能结合溶液中阳离子。我们发现在含 0.1mM EDTA 的 DEPC 水保存的 RNA 在-80可保存 2 年而完整。所用试剂：怎样才能降低背景？有以下方法：1. 降低探针浓度；2.提高杂交温度；3.减少杂交时间；4.增加封闭剂浓度；5.减少抗体用量；6.降低发光底物浓度；7.缩短暴光时间8.提高洗膜的严谨度这些方法有选择性的使用，一般按我的先后顺序选择。
