1、XXX实验室检测中心管理体系文件作业指导书（第 A 版 第 0 次修改）文件编号：编写：审核：批准：批准日期：受控状态： 受控 非受控正副版本： 正本 副本持有者：发布日期： 实施日期：文件编号：作业指导书第页 共页第 A 版 第 0 次修改标 题：水产品中孔雀石绿的测定 颁布日期：2014 年 月 日1. 目的使孔雀石绿的测定处于受控状态，保证孔雀石绿检测结果的准确性与一致性；规范参加本项目检测工作人员的操作规程。2. 适用范围本作业指导书规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的酶联免疫测定方法。本作业指导书适用于鱼、虾以及鱼池或者鱼缸水样中的总的孔雀石绿残留量的检测。3. 引用
2、依据孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒使用说明书。水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的快速筛选测定 酶联免疫法 DB34/T 1421-2011水产品中孔雀石绿和结品紫及其代谢产物的快速测定方法 SN/T 1768-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法 GB/T 20361-20064. 概述孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，既是杀真菌剂，又是染料。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿在鱼体内残留时间长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。5.
3、 酶联免疫吸附法5.1. 原理本孔雀石绿类酶联免疫检验试剂，主要是利用还原剂将样品中的孔雀石绿还原成隐性孔雀石绿后，利用抗原与抗体之特异性免疫化学反应的基本原理来进行的，换句话说，就是利用酶标记物与样品中之隐性孔雀石绿对微孔中之抗体来进行竞争反应。在整个反应当中，如果样品中之隐性孔雀石绿残留的越多，相对地就会竞争掉越多的抗体，使得结合了与微孔盘上包被的抗原结合抗体的二次抗体相对地就会减少。因此，反应中之酶标记物结合体-底物溶液之呈色就会很淡，甚至几乎没有颜色，此即为阳性反应。反之，若样品中没有含隐性孔雀石绿，则呈色会比较深，与阴性标准品呈色几乎是一样的，此即为阴性反应。5.2. 试剂和材料5.
4、2.1. 实验室用试剂：所用试剂除另有规定外，均为分析纯。水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。文件编号：作业指导书第页 共页第 A 版 第 0 次修改标 题：水产品中孔雀石绿的测定 颁布日期：2014 年 月 日5.2.2. 乙酸乙酯。5.2.3. 正己烷。5.2.4. 12N 盐酸溶液5.2.5. 孔雀石绿酶联免疫试剂盒5.3. 仪器和设备5.3.1. 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。5.3.2. 分析天平：感量 0.001g，感量 0.0001g。5.3.3. 恒温培养箱。5.3.4. 均质器。5.3.5. 旋涡振荡器。5.3.6. 离心机：离心力4000g。5.3.7. 氮吹
5、仪5.3.8. 微量单道/多道移液器：10L100L；100L1000L； 50L300L。5.3.9. 水浴锅。5.3.10. 聚四氟乙烯离心管：5mL，50mL，具塞。5.4. 样品处理5.4.1. 将 2 克已均质之样品放入 15mL 离心管中，加入 0.4%还原剂 3mL 后立刻震荡 1 分钟使成肉浆状。5.4.2. 静置 30 分钟。5.4.3. 再加入 6mL 0.002N 盐酸-乙酸乙酯，震荡 1 分钟。5.4.4. 以离心机离心 1700g(约 3500rpm)10 分钟。5.4.5. 离心后若于上层有机层内观察到白色胶状物时，用竹棒或移液枪头搅拌上层有机层后再次以 1700g
6、(约 3500rpm)离心 10 分钟。5.4.6. 取 3mL 上层液(盐酸-乙酸乙酯)至 10mL 玻璃管中，于 60下，利用氮气将有机溶剂吹干。5.4.7. 于此玻璃管中加入正己烷 1mL ,剧烈震荡将残余物完全溶解(若氮吹后的管内有很多油脂时，可将正己烷加入量改为 2mL。)。5.4.8. 缓缓加入 1mL 样品稀释液，轻柔混合震荡(vortex) 1 分钟。5.4.9. 以离心机离心 1700g(约 3500rpm) 10 分钟。5.4.10. 若离心后不能确实分层而在两层问出现乳化层时，请置于沸水中隔水加热至上下确实分文件编号：作业指导书第页 共页第 A 版 第 0 次修改标 题：
7、水产品中孔雀石绿的测定 颁布日期：2014 年 月 日层，待玻璃管冷却至室温后再次以离心机离心 1700g(约 3500rpm) 10 分钟。用吸管吸去上层液(正己烷)，再吸取下层液(水层)备用稀释倍数：15.5. 酶联免疫测定5.5.1. 使用前将试剂盒置于室温(20-25)平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于 2-8不要冷冻;5.5.2. 于适当微孔分别加入 100L 隐性孔雀石绿标准液。5.5.3. 在另外的微孔加入 100L 已完成前处理之样品溶液。5.5.4. 再于每一微孔另再加入 100L 的
8、 1 倍隐性孔雀石绿抗体。5.5.5. 轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应 30 分钟。5.5.6. 将微孔中之反应液甩掉，再将 300L 的 1 倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗 3 次。5.5.7. 最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。5.5.8. 于每一微孔加入 100L 的 1 倍二次抗体。5.5.9. 轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应 30 分钟。5.5.10. 将微孔中之反应液甩掉，再将 300L 的 1 倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗 3 次。5.5.11. 最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。5.5.12. 于每一微孔加入底物溶液 100L。5.5.13.
9、轻敲盘子四周，使其充分混合后室温卜反应 20 分钟。5.5.14. 加入反应终止液，每一微孔加入 100L。5.5.15. 酶标仪以单波长 450 nm 或双波长 450 nm/650 nm 判读。5.6. 结果判定5.6.1. 定性判定用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含孔雀石绿浓度范围(ng/ml)。假设样品 1 的吸光度值为 0.313，样品 2 的吸光度值为 1.032，标准液吸光度值分别是:0ppb 为1.892；0.025ppb 为 1.501；0.05ppb 为 1.175；0.1ppb 为 0.751；0.3ppb 为 0.421；0.6ppb 为0.198。则样品
10、 1 的浓度范围 0.3ppb-0.6ppb;样品 2 的浓度范围 0.05ppb-0.lppb。(再乘以相应的稀释倍数)文件编号：作业指导书第页 共页第 A 版 第 0 次修改标 题：水产品中孔雀石绿的测定 颁布日期：2014 年 月 日5.6.2. 定量判定所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0 标准)的吸光度值(B O)再乘以 100%，即百分吸光度值。百分吸光度 值 （ %） =0100%B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值。BO0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以孔雀石绿标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准曲
11、线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中孔雀石绿的实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。5.7. 方法的检出限、回收率、重复性5.7.1. 检出限本方法孔雀石绿及其代谢残留物的检出限为 0.2g/kg。5.7.2. 回收率在样品中添加 0.1g/kg4g/kg 浓度水平时，回收率为 70120。5.7.3. 重复性本方法的批内变异系数10，批间变异系数10。5.8. 结果表述当所对应的样品的测定值小于其检出限时，报告为孔雀石绿未检出。当测定值大于检出限时，报告为孔雀石绿检出。出现阳性值时（超过
12、相关标准、规定的限量值） ，需用液相色谱-串联质谱法（LC/MS-MS）加以确证。6. 液相色谱法6.1. 原理试样中的残留的孔雀石绿、结晶紫及其代谢物用孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、浓缩后用液相色谱进行检测，外标法定量。6.2. 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。6.2.1. 乙腈:色谱纯。6.2.2. 无水乙酸钠。文件编号：作业指导书第页 共页第 A 版 第 0 次修改标 题：水产品中孔雀石绿的测定 颁布日期：2014 年 月 日6.2.3. 冰乙酸:色谱纯。6.2.4. 异丙醇。6.2.5. 对-甲苯磺酸。6.2.6. 乙酸盐缓冲液:称取 4
13、.950g 无水乙酸钠及 0.950g 对-甲苯磺酸，溶解于 950 mL 水中，用冰乙酸调节溶液 pH 到 4.5，最后用水定容到 1000mL。6.2.7. 标准品:孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫纯度大于 98%。6.2.8. 标准贮备溶液:准确称量孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫各 10mg，用乙睛分别定容于 100mL 容量瓶中，配制成 100g/mL 的标准贮备液。6.2.9. 混合标准溶液:用流动相稀释标准贮备溶液，配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为 10g/mL 的混合标准溶液。04避光保存。6.2.10. 孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试
14、剂盒。6.3. 仪器和设备6.3.1. 高效液相色谱仪:配紫外-可见光可变波长检测器；检测波长时间程序可控。6.3.2. 匀浆机。6.3.3. 旋转蒸发仪。6.3.4. 离心机:4000r/min,8000r/min。6.3.5. 振荡器。6.3.6. 超声波水浴。6.3.7. 聚四氟乙烯离心管:2.5mL,50mL，具塞。6.3.8. 微孔滤膜:0.45m。6.4. 测定步骤6.4.1. 提取、净化准确称取已捣碎的样品 5.00g 于 50mL 离心管中，先加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中的提取剂(液体 20.0mL)、用匀浆机以 8OOOr/min 的速度均质 30s，再加入提取
15、剂 2(固体粉末)，振荡 1min,4000r/min 离心 5min，取上清液 10.0mL 于鸡心瓶中再加入异丙醇10mL5055水浴旋转蒸干。残留物用 1.0mL 流动相溶解，溶解液放人 2.5mL 离心管中，8000r/min 离心 5min 后，用微孔滤膜过滤，滤液供仪器测定。6.4.2. 绘制标准工作曲线移取孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结品紫混合标准溶液，用流动相稀释成 2 ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL 标准工作溶液，用高效液相色谱仪测定，得出标准工作曲线。6.4.3. 测定6.4.3.1. 液相色谱条件a) 色谱往:C 18柱，250mm4
16、.6 mm(内径)，粒度 5m；b) 流动相:乙腈+乙酸盐缓冲液（80+20，体积分数);c) 流速：1.0mL/min；d) 柱温：室温；e) 检测波长时间程序:0min5.0min,618nm;0min12min,588nm;12min18min,267nm;孔雀石绿的检测波长为 618nm，结晶紫的检测波长为 588nm,隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的检测波长为 267nm。f) 进样量：50L。6.4.3.2. 色谱测定根据样液中孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的响应值均应在仪器的
17、检测线性范围内。在上述色谱条件下，孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的保留时间约为孔雀石绿 4.0min,隐色孔雀石绿 13.6min、结晶紫 5.4min 和隐色结晶紫14.7min。标准品色谱图参见附录 A 中图 A.1。6.4.4. 空白实验除不加试样外，按上述测定步骤进行。6.5. 结果计算用色谱数据处理机或按下式分别计算供试样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。=2式中:w 水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量，单位为微克每千克(g/kg)；ci 标准曲线上查出试样溶液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准工作溶液的浓度，单位为
18、微克每升(g/L)；V 最终定容体积数，单位为毫升(mL)；2 换算常数;m 供试试料样品质量，单位为克(g)。本方法分别计算孔雀石绿及代谢产物隐色孔雀石绿，并分别报告孔雀石绿及代谢产物隐色孔雀石绿结果。文件编号：作业指导书第页 共页第 A 版 第 0 次修改标 题：水产品中孔雀石绿的测定 颁布日期：2014 年 月 日本方法分别计算结晶紫及代谢产物隐色结晶紫，并分别报告结晶紫及代谢产物隐色结晶紫结果。6.6. 检测限本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为 2.0g/kg。6.7. 回收率本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫回收率为:85%105%。7. 高效
19、液相色谱荧光检测法7.1. 原理样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐色孔雀石绿或隐色结晶紫，乙腈-乙酸铵缓冲混合液提取，二氯甲烷液液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。7.2. 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合 GB/T 6682 一级水的标准。7.2.1. 乙腈:色谱纯。7.2.2. 二氯甲烷。7.2.3. 酸性氧化铝:分析纯，粒度 0.071mm0.150mm。7.2.4. 二甘醇。7.2.5. 硼氢化钾。7.2.6. 无水乙酸铵。7.2.7. 冰乙酸。7.2.8. 氨水。7.2.9. 硼氢化钾溶液0.03mol/
20、L:称取 0.405g 硼氢化钾于烧杯中，加 250mL 水溶解，现配现用。7.2.10. 硼氢化钾溶液0.2mol/L:称取 0.54g 硼氢化钾于烧杯中，加 50mL 水溶解，现配现用。7.2.11. 20%盐酸羟胺溶液:溶解 12.5g 盐酸羟胺在 50m 水中。7.2.12. 对-甲苯磺酸溶液0.05mol/L:称取 0.95g 对-甲苯磺酸，用水稀释至 100mL。7.2.13. 乙酸铵缓冲溶液0.1mol/L:称取 7.71g 无水乙酸铵溶解于 1000 mL 水中，氨水调 pH到 10.0。7.2.14. 乙酸铵缓冲溶液0.125mol/L:称取 9.64g 无水乙酸铵溶解于 1
21、000mL 水中，冰乙酸调pH 到 4.5。文件编号：作业指导书第页 共页第 A 版 第 0 次修改标 题：水产品中孔雀石绿的测定 颁布日期：2014 年 月 日7.2.15. 酸性氧化铝固相萃取柱:500mg，3mL。使用前用 5mL 乙腈活化。7.2.16. Varian PRS 柱或相当者:500mg,3mL。使用前用 5mL 乙腈活化。7.2.17. 标准品:孔雀石绿(MG)分子式为(C 23H25N2)(C2HO4)2C2H2O4、结晶紫(GV)分子式为C25H29CIN3，纯度大于 98%。7.2.18. 标准储备溶液:准确称取适量的孔雀石绿、结晶紫标准品，用乙腈分别配制成100g
22、/mL 的标准贮备液。7.2.19. 混合标准中间液(1g/mL):分别准确吸取 l.00 mL 孔雀石绿和结晶紫的标准储备溶液至 100mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成 1g/mL 的混合标准中间溶液。-18避光保存。7.2.20. 混合标准工作溶液:根据需要，临用时准确吸取一定量的混合标准中间溶液，加人硼氢化钾溶液(7.2.9)0.40mL，用乙腈准确稀释至 2.00mL，配制适当浓度的混合标准工作液。7.3. 仪器与设备7.3.1. 高效液相色谱仪:配荧光检测器。7.3.2. 匀浆机。7.3.3. 离心机:4000r/min。7.3.4. 旋涡振荡器。7.3.5. 固相萃取装置。
23、7.3.6. 旋转蒸发仪。7.4. 样品制备7.4.1. 取样鱼去鳞、去皮，沿背脊取肌肉部分；虾去头、壳、肠腺，取肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食部分。样品切为不大于 0.5cm0.5cm0.5cm 的小块后混合。7.4.2. 提取称取 5.00g 样品于 50mL 离心管内，加入 10mL 乙腈,1000r/min 匀浆提取 30s，加入 5g 酸性氧化铝，振荡 2min, 4000r/min 离心 10min，上清液转移至 125mL 分液漏斗中，在分液漏斗中加入 2mL 二甘醇，3mL 硼氢化钾溶液(7.2.10)，振摇 2min。另取 50mL 离心管加入 10mL 乙腈，洗涤匀浆机刀头 1
24、0s，洗涤液移入前一离心管中，加入3mL 硼氢化钾溶液(7.2.10)，用玻棒捣散离心管中的沉淀并搅匀，漩涡混匀器上振荡 1min，静置 20min,4000r/min 离心 10min，上清液并入 125mL 分液漏斗中。在 50mL 离心管中继续加入 1.5mL 盐酸羟胺溶液(7.2.11),2.5mL 对-甲苯磺酸溶液(7.2.12) ,5.0mL 乙酸铵缓冲溶液(7.2.14)，振荡 2min，再加入 10mL 乙腈，继续振荡 2min， 文件编号：作业指导书第页 共页第 A 版 第 0 次修改标 题：水产品中孔雀石绿的测定 颁布日期：2014 年 月 日4000r/min 离心 10
25、min，上清液并入 125mL 分液漏斗中，重复上述操作一次。在分液漏斗中加人 20mL 二氯甲烷，具塞，剧烈振摇 2min，静置分层，将下层溶液转移至250mL 茄形瓶中，继续在分液漏斗中加入 5mL 乙腈、10mL 二氯甲烷，振摇 2min，把全部溶液转移至 50mL 离心管，4000r/min 离心 10min，下层溶液合并至 250mL 茄形瓶，45旋转蒸发至近干，用 2.5mL 乙腈溶解残渣。7.4.3. 净化将 PRS 柱安装在固相萃取装置上，上端连接酸性氧化铝固相萃取柱，用 5mL 乙腈活化，转移提取液到柱上，再用乙腈洗茄形瓶两次，每次 2.5mL，依次过柱，弃去酸性氧化铝柱，吹
26、 PRS柱近干，在不抽真空的情况下，加入 3mL 等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液(7.2.13)，收集洗脱液，乙腈定容至 3mL，过 0.45m 滤膜，供液相色谱测定。7.5. 测定7.5.1. 色谱条件7.5.1.1. 色谱柱:ODS-C 18柱，250mm4.6mm(内径)，粒度 5m。7.5.1.2. 流动相:乙腈+乙酸铵缓冲溶液(0.125mol/L,pH4.5)=80+2O。7.5.1.3. 流速：1.3mL/min。7.5.1.4. 柱温：35。7.5.1.5. 激发波长：265nm。7.5.1.6. 发射波长：360nm。7.5.1.7. 进样量:20L。7.5.2. 色谱分析分别注入 20L 孔雀石绿和结晶紫混合标准工作溶液及样品提取液于液相色谱仪中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准品的保留时间定性，外标法定量。标准品色谱图参见附录 A。
