1、浅析生物化学中的关键技术学校：assf院系：生物技术班级：117学号：05姓名：lee电话：12842516521浅析生物化学中的关键技术关键技术一：电泳 电泳（Electrophoresis）是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象称为电泳。大分子的蛋白质，多肽，病毒粒子，甚至细胞或小分子的氨基酸，核苷等在电场中都可作定向泳动.1937 年 Tiselius成功地研制了界面电泳仪进行血清蛋白电泳，它是在一 U型管的自由溶液中进行的，电泳后用光学系统使各种蛋白所形成折光率差别成为曲线图象，将血清蛋白分为白蛋白，1-球蛋白，2-球蛋白，-球蛋白和 -球蛋白五种，随后，Wielamd 和 Kani
2、g 等于1948年采用滤纸条做载体，成功地进行了纸上电泳。从那时起，电泳技术逐渐被人们所接受并予以重视，继而发展以滤纸，各种纤维素粉，淀粉凝胶，琼脂和琼脂糖凝胶，醋酸纤维素薄膜，聚丙烯酰胺凝胶等为载体，结合增染试剂如银氨染色，考马斯亮蓝等大大提高和促进生物样品着色与分辨能力，此外电泳分离和免疫反应相结合，使分辨率不断朝着微量和超微量（1ng0.001ng）水平发展，从而使电泳技术获得迅速推广和应用。在此主要介绍常用电泳的一般原理及其应用. 电泳的基本原理如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷 Q和电位梯度 E.它们与介质的摩擦阻
3、力 f抗衡。在自由溶液中这种抗衡服从 Stokes定律. F=6rv 这里 v是在介质粘度为 中半径为 r的颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种抗衡并不完全符合 Stokes定律.F 取决于介质中的其他因子，如凝胶厚度，颗粒大小，甚至介质的内渗等。 电泳迁移率(mbility)m 规定为在电位梯度 E的影响下，颗粒在时间 t中的迁移距离 d. d m= - 或 m=V / E tE 迁移率的不同提供了从混合物中分离物质的基础，迁移距离正比于迁移率。影响电泳的因素1.电泳介质的 pH值 2.缓冲液的离子强度 3. 电场强度 4.电渗现象 电泳所需的仪器 电泳所需的仪器有：电泳槽和电源。 电泳技术的应
4、用1 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定 2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量. 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量。 4 琼脂或琼脂糖凝胶免疫 关键技术二：超离心胶 体 粒 子 在 重 力 场 或 普 通 的 离 心 力 场 中 沉 降 极 为 缓 慢 ， 实 际 上 无 法 测 定其 沉 降 速 度 。 1924 年 瑞 典 科 学 家 Svedberg 研 制 成 超 离 心 机 ， 其 转 速 比 普 通离 心 机 大 大 提 高 ， 现 在 超 离 心 机 的 离 心 加 速 度 已 达 到 重 力 加 速 度 的 106 以上 ， 从 而 可 以 对 胶 体 粒
5、 子 进 行 沉 降 分 离 和 分 析 ， 这 称 作 超 离 心 法 。 超 离 心 法是 瑞 典 化 学 家 Svedberg 于 1940 年 设 计 的 ， 广 泛 地 用 于 蛋 白 质 分 子 的 分 离 与分 析 。 他 所 采 用 的 原 理 是 蛋 白 质 颗 粒 会 在 250000500000g 的 离 心 作 用 下 从溶 液 中 沉 降 下 来 。数据表:型号 零件号转筒驱动:马达: 1MJ6 1250.180.99-82变频器: ACS550-01-045A-4 1028.296.30螺旋驱动:马达: 1MJ6 1250.132.70变频器: ACS550-01-
6、015A-4 1028.300.30齿轮箱油位: UNS-1000 1125.027.10转筒主转速与差速测量福乐伟离心机带SIMP-DRIVE1. 主转速：转筒主转速在离心机的齿轮凸边缘，由触点式感应转换器测量。转换器每旋转一次，发出4次脉冲信号。因此，输入频率也被分成4次，转换器将每分钟转数转换为主转速，同时监测。2. 螺旋差速：螺旋差速在齿轮输入轴处，由触点式感应转换器测得。转换器每旋转一次，发出4次脉冲信号。因此，输入频率也被分成4次；同时，也产生了齿轮输入轴的速度。输入轴的速度由齿轮传动速比分配，转换器将每分钟转数转换为差转速，同时监测。关键技术三：同位素标记同 位 素 标 记 法
7、： 同 位 素 可 用 于 追 踪 物 质 的 运 行 和 变 化 规 律 。 借 助 同 位 素原 子 以 研 究 有 机 反 应 历 程 的 方 法 。 即 同 位 素 用 于 追 踪 物 质 运 行 和 变 化 过 程时 ， 叫 做 示 踪 元 素 。 用 示 踪 元 素 标 记 的 化 合 物 ， 其 化 学 性 质 不 变 。 科 学 家通 过 追 踪 示 踪 元 素 标 记 的 化 合 物 ， 可 以 弄 清 化 学 反 应 的 详 细 过 程 。 这 种 科 学研 究 方 法 叫 做 同 位 素 标 记 法 。基 本 原 理同 位 素 示 踪 所 利 用 的 放 射 性 核 素
8、（ 或 稳 定 性 核 素 ） 及 它 们 的 化 合 物 ， 与自 然 界 存 在 的 相 应 普 通 元 素 及 其 化 合 物 之 间 的 化 学 性 质 和 生 物 学 性 质 是 相 同的 ， 只 是 具 有 不 同 的 核 物 理 性 质 。 因 此 ， 就 可 以 用 同 位 素 作 为 一 种 标 记 ， 制成 含 有 同 位 素 的 标 记 化 合 物 （ 如 标 记 食 物 ， 药 物 和 代 谢 物 质 等 ） 代 替 相 应 的非 标 记 化 合 物 。 利 用 放 射 性 同 位 素 不 断 地 放 出 特 征 射 线 的 核 物 理 性 质 ， 就 可以 用 核 探
9、 测 器 随 时 追 踪 它 在 体 内 或 体 外 的 位 置 、 数 量 及 其 转 变 等 ， 稳 定 性同 位 素 虽 然 不 释 放 射 线 ， 但 可 以 利 用 它 与 普 通 相 应 同 位 素 的 质 量 之 差 ， 通 过质 谱 仪 ， 气 相 层 析 仪 ， 核 磁 共 振 等 质 量 分 析 仪 器 来 测 定 。 放 射 性 同 位 素 和 稳定 性 同 位 素 都 可 作 为 示 踪 剂 （ tracer） ， 但 是 ， 稳 定 性 同 位 素 作 为 示 踪 剂其 灵 敏 度 较 低 ， 可 获 得 的 种 类 少 ， 价 格 较 昂 贵 ， 其 应 用 范 围
10、 受 到 限 制 ； 而用 放 射 性 同 位 素 作 为 示 踪 剂 不 仅 灵 敏 度 ， 测 量 方 法 简 便 易 行 ， 能 准 确 地 定量 ， 准 确 地 定 位 及 符 合 所 研 究 对 象 的 生 理 条 件 等 特 点 。三 、 同 位 素 标 记 法 在 生 物 化 学 和 分 子 生 物 学 中 的 应 用 放射性同位素标记法在生物化学和分子生物学领域应用极为广泛，它为揭示体内和细胞内理化过程的秘密，阐明生命活动的物质基础起了极其重要的作用。近几年来，同位素标记技术在原基础上又有许多新发展，如双标记和多标记技术，稳定性同位素标记技术，活化分析，电子显微镜技术，同位素技
11、术与其它新技术相结合等。由于这些技术的发展，使生物化学从静态进入动态，从细胞水平进入分子水平，阐明了一系列重大问题，如遗传密码、细胞膜受体、RNA-DNA 逆转录等，使人类对生命基本现象的认识开辟了一条新的途径。下面仅就同位素标记技术在生物化学和分子生物学中应用的几个主要方面作一介绍。关键技术四：层析层析（chromatography）是“色层分析”的简称。利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。层析利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的
12、有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。基 本 原 理层 析 须 在 两 相 系 统 间 进 行 。 一 相 是 固 定 相 ， 需 支 持 物 ， 是 固 体 或 液 体 。 另 一 相 为 流动 相 ， 是 液 体 或 气 体 。 当 流 动 相 流 经 固 定 相 时 ， 被 分 离 物 质 在 两 相 间 的 分 配 ， 由 平 衡 状态 到 失 去 平 衡 到 又 恢 复 平 衡 ， 即 不 断 经 历 吸 附 和 解 吸 的 过 程 。 随 着 流 动 相 不 断 向 前 流 动 ，被 分 离 物 质 间 出 现 向 前 移 动 的 速 率 差 异 ， 由 开 始 的 单 一 区
13、带 逐 渐 分 离 出 许 多 区 带 ， 这 个过 程 叫 展 层 。 系 数 K 是 物 质 在 两 相 中 的 浓 度 比 。 K 值 大 ， 则 在 固 定 相 中 吸 附 牢 ， K 值 小 吸 附差 。 各 物 质 间 的 K 值 差 别 大 ， 则 易 被 分 离 。 不 同 类 型 层 析 的 K 值 含 义 不 同 ， 可 视 为吸 附 平 衡 常 数 ， 分 配 常 数 或 离 子 交 换 常 数 等 。 研 究 层 析 现 象 而 发 展 的 塔 板 理 论 ， 与 有 机 化 学 实 验 中 的 分 馏 法 原 理 有 些 相 似 。 被分 馏 的 有 机 溶 剂 在
14、分 馏 柱 内 的 填 充 物 上 形 成 许 多 热 交 换 层 ， 从 而 把 低 沸 点 溶 剂 先 分 馏出 来 ， 达 到 纯 化 的 目 的 。 在 层 析 时 用 理 论 塔 板 数 n 来 衡 量 层 析 效 能 。 tR 为 物 质 在 层 析 柱 上 的 保 留 时 间 ， W 为 洗 脱 下 来 的 物 质 峰 形 的 宽 度 。 n 值 愈 大表 示 层 析 柱 的 效 能 愈 高 。 如 用 理 论 塔 板 高 度 H 表 示 ， 则 包 含 了 层 析 柱 长 度 的 因 子 。 式 中 L 为 层 析 柱 的 柱 长 。 H 值 越 大 ， 则 柱 效 越 低 。
15、 此外影响层析分离效果的还有涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等因素。因此选择层析固定相支持物的粒度、均匀度等物理性能，流动相的层析系统和温度等都是做好层析的关键。 几 种 常 用 的 层 析吸 附 层 析 、 分 配 层 析 、 离 子 交 换 层 析 、 凝 胶 过 滤 层 析 、 亲 和 层 析 气 相 层 析 、 纸 层 析薄 层 层 析 、 高 效 液 相 层 析 （ 又 名 高 压 液 相 色 谱 ） 、 反 相 层 析 、 同 系 层 析 层 析 法 的 最 大 特 点 是 分 离 效 率 高 ， 它 能 分 离 各 种 性 质 极 相 类 似 的 物 质 。 而 且 它 既 可以 用
16、 于 少 量 物 质 的 分 析 鉴 定 ， 又 可 用 于 大 量 物 质 的 分 离 纯 化 制 备 。 因 此 ， 作 为 一 种 重 要的 分 析 分 离 手 段 与 方 法 ， 它 广 泛 地 应 用 于 科 学 研 究 与 工 业 生 产 上 。 现 在 ， 它 在 石 油 、 化工 、 医 药 卫 生 、 生 物 科 学 、 环 境 科 学 、 农 业 科 学 等 领 域 都 发 挥 着 十 分 重 要 的 作 用 。 层 析 根 据 固 定 相 基 质 的 形 式 分 类 ， 层 析 可 以 分 为 纸 层 析 、 薄 层 层 析 和 柱 层 析 。 其 中纸 层 析 是 指
17、以 滤 纸 作 为 基 质 的 层 析 。关键技术五： X射线光电子 。X 射线光电子能谱基于光电离作用，当一束光子辐照到样品表面时，光子可以被样品中某一元素的原子轨道上的电子所吸收，使得该电子脱离原子核的束缚，以一定的动能从原子内部发射出来，变成自由的光电子，而原子本身则变成一个激发态的离子。 在光电离过程中，固体物质的结合能可以用下面的方程表示：Ek = h - Eb - s （18.1）式中 Ek 出射的光电子的动能, eV;h X 射线源光子的能量, eV；Eb 特定原子轨道上的结合能, eV；s 谱仪的功函 , eV。谱仪的功函主要由谱仪材料和状态决定，对同一台谱仪基本是一个常数，与
18、样品无关，其平均值为 34eV。在 XPS 分析中，由于采用的 X 射线激发源的能量较高，不仅可以激发出原子价轨道中的价电子，还可以激发出芯能级上的内层轨道电子，其出射光电子的能量仅与入射光子的能量及原子轨道结合能有关。因此，对于特定的单色激发源和特定的原子轨道，其光电子的能量是特征的。当固定激发源能量时，其光电子的能量仅与元素的种类和所电离激发的原子轨道有关。因此，我们可以根据光电子的结合能定性分析物质的元素种类。在普通的 XPS 谱仪中，一般采用的 Mg K 和 Al K X 射线作为激发源，光子的能量足够促使除氢、氦以外的所有元素发生光电离作用，产生特征光电子。由此可见，XPS 技术是一
19、种可以对所有元素进行一次全分析的方法，这对于未知物的定性分析是非常有效的。经 X 射线辐照后，从样品表面出射的光电子的强度是与样品中该原子的浓度有线性关系，可以利用它进行元素的半定量分析。鉴于光电子的强度不仅与原子的浓度有关，还与光电子的平均自由程、样品的表面光洁度，元素所处的化学状态，X 射线源强度以及仪器的状态有关。因此， XPS 技术一般不能给出所分析元素的绝对含量，仅能提供各元素的相对含量。由于元素的灵敏度因子不仅与元素种类有关，还与元素在物质中的存在状态，仪器的状态有一定的关系，因此不经校准测得的相对含量也会存在很大的误差。还须指出的是，XPS是一种表面灵敏的分析方法，具有很高的表面检测灵敏度，可以达到 10-3原子单层，但对于体相检测灵敏度仅为 0.1%左右。XPS 是一种表面灵敏的分析技术，其表面采样深度为 2.05.0 nm，它提供的仅是表面上的元素含量，与体相成分会有很大的差别。而它的采样深度与材料性质、光电子的能量有关，也同样品表面和分析器的角度有关。
