1、猪肉中瘦肉精的检测猪肉中瘦肉精的检测高峰101279012摘 要鉴于盐酸克伦特罗(瘦肉精)在动物性食品中的残留对人体和国民经济造成了巨大的危害，本文介绍了动物肌肉组织中残留盐酸克伦特罗(瘦肉精) 的几种分析检测方法，并对未来的发展方向作了展望。关键词：瘦肉精 GC-MS HPLC ELISA1 引言 瘦肉精是一类药物，而不是某一种特定的药物，任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精” 。在中国，通常所说的瘦肉精是指克伦特罗(Clenbuterol，CLB) ，而普通消费者则把此类药物统称为瘦肉精。当它们以超过治疗剂量 510 倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应
2、”促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此，受体激动剂被大量非法用于畜牧生产，其中最常用的有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。长期食用含有 受体激动剂残留的食品将对人体健康产生极大的危害，可诱发和加重心率失常病人的病情，引起心室早搏，四肢、脸、颈部骨骼肌震颤；另外还能引起代谢紊乱，对糖尿病人可发生酸中毒或酮中毒。 1盐酸克伦特罗(Clenbuteerol ，CLB) ，又名克喘素、氨哮素、双氯醇胺，俗名瘦肉精，化学名为 (叔丁氨基) 甲基4 氨基3，5二氯苯甲醇盐酸盐，分子式为 C12 H18Cl12N2OHCl ，相对分子质量为 31
3、3.65。目前，检测瘦肉精残留常用的色谱技术有高效液相色谱(HPLC) 、气相色谱质谱联用法(GCMS)、高效液相色谱质谱联用法 (HPLCMS) 、毛细管电泳法(CE)等。中国已将高效液相色谱法（HPLC）作为检测饲料中盐酸克伦特罗残留的半确证法， 将 GCMS 法定为确证性方法，主要用于最后确认和仲裁。对于动物性食品，GB/T 5009.1922003 “动物性食品中克伦特罗残留量的测定”规定的第一法为气相色谱质谱法，第二法为高效液相色谱法，第三法为酶联免疫法。下面将会对这三种方法逐一进行说明，并简单介绍毛细管电泳法（CE） 。猪肉中瘦肉精的检测2 动物性食品（猪肉）中盐酸克伦特罗的检测方
4、法 2.1 气相色谱质谱法(GCMS) GCMS 法优点是把色谱高效快速的分离效果和质谱高灵敏度的定性分析有机结合起来，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，而且具更高的检测极限。GCMS 法与 HPLC 法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低。下面将以岛津公司采用的 GCMS 法检测瘦肉精为例，对仪器与试剂的选择、样品的处理方法等方面进行介绍。2.1.1 仪器与试剂仪器：岛津 GCMSQP2010 Plus；试剂：盐酸克伦特罗（Clenbuterol ，CLB）标准品，内标（ClenbuterolD9， CLBD9） ，N ，O双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）
5、 ，C18 固相萃取小柱（100 mg， 3 mL）标准溶液的配制：准确称取盐酸克伦特罗和内标的标准品，用甲醇配成浓度为 1 mg/mL 的标准储备液，放置于 4冰箱中避光保存，使用时用甲醇稀释成 1g/mL 的标准使用液和内标使用液。2.1.2 分析条件色谱柱：Rtx5MS (30 m0.25 mm0.25 m)进样口温度：220柱温程序：70(0.6 min)25/min220(6 min)25/min280(5 min)恒线速度方式， 柱流量 0.9 mL/min不分流进样，进样时间 1 min接口温度：280 离子源温度：200 溶剂切割时间：8 min检测离子：CLB：检测 m/z
6、86， 187， 243， 262，CLBD9：检测 m/z 95， 187， 262以克伦特罗 (m/z86) 与内标峰 (m/z 95) 的峰面积比校准定量。2.1.3 样品制备精密称取(2 0.01) g 己绞碎的猪肉于具塞离心管中，加入 4 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液，旋涡振荡 5 min，超声 10 min， 12000 r/min 离心 5 min 后，倾出上清液，沉淀再分别用 0.1 mol/L 盐酸 4 mL，2 mL 两次提取，提取方法同上，合并上清液。将上清液全部上样至 C18 柱，用 5 mL 水清洗小柱后，使用 0.8 mL 甲醇：20 mmol/L 磷酸溶液=
7、1： 1(v/v)的酸化甲醇解析，加磷酸缓冲液调至 pH=7，定容至 2 mL。将该溶液以 0.1 mL/min 的流速推过聚（甲基丙烯酸乙二醇二甲基丙烯酸酯）毛细管整体柱萃取后，用 0.2 mL 的甲醇解析，加 50 L 的内标使用液后以氮吹仪浓缩至干。加入 100 L 甲苯和 100 LBSTFA，涡旋混匀 30 s，置于微波炉中小火衍生 5 min。衍生反应完成后取出冷却至室温后再加入300 L 甲苯，充分混匀，待气质联用仪进样。猪肉中瘦肉精的检测2.1.4 结论该法在样品提取后，用 C18 小柱和聚（甲基丙烯酸乙二醇二甲基丙烯酸酯）整体柱进一步富集净化，经 N ，O双三甲基硅烷三氟乙酰
8、胺 (BSTFA) 衍生，选择离子监测方式进行气相色谱质谱测定。该方法具有检测限低、重现性好、回收率高、样品用量少等特点，适合于猪肉样品中盐酸克伦特罗的定性、定量测定。但 GCMS 的缺点是检测过程烦琐、检测时间长、需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。2.2 高效液相色谱法(HPLC) 2 HPLC 适合测定热不稳定和强极性的 激动剂及其代谢产物，而且 HPLC可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱(MS)等系统联用，容易实现分析过程的自动化。HPLC 法中常用的检测器有电化学检测器、紫外检测器。2.2.1 材料与仪器甲醇：色谱纯；试验用水：均为超纯水；其余试剂：均为分析纯；盐酸克伦特罗标
9、准品：中国药品生物制品检定所；盐酸克伦特罗标准溶液： 取盐酸克伦特罗标准品 24. 98 mg 置于 25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成含盐酸克伦特罗 1 mg/mL 的标准贮备液，贮于冰箱中，不同浓度的系列标准溶液由标准储备液稀释而得；Dionex AT330 (美国) 高效液相色谱仪：由 P680 四元泵、UVD170U 紫外检测器和 AT330 恒温箱组成；超声波提取器( SB25200BTD) ；离心机(6 000 r/min) ；DSY22 型电热恒温水浴锅。2.2.2 色谱条件色谱柱采用 Diamonsil ODS2C18 柱( 5 m， 150 mm 4. 6 mm
10、 I. D) ；检测波长为 244 nm； 流动相甲醇水=26 74；流速 1. 0 mL /min； 柱温 30 ；进样量 20L。2.2.3 样品制备取 10 g 绞碎肉试样，加 0. 1 mol/L 高氯酸 20 mL 匀浆，超声提取 20 min， 80 加热 30 min， 冷却后离心(4 000 r/min) 15 min。沉淀加 0. 1 mol/L高氯酸 5 mL 洗涤、离心，将上清液合并，用 1 mol/L 氢氧化钠调 pH 至 11，加入 25 mL 乙醚，振荡提取 20 min，回收有机相，再用 20 mL 乙醚重复萃取 2 次，合并有机相，蒸发至干。用 0. 1 mol
11、/L HC1 溶解，纯水定容至 10 mL。2.2.4 结论目前，中国已将 HPLC 法作为检测 CLB 残留的半确证性方法，最低检测限范围为 115ng/g，其优点是专属性好、选择性强、检测精确度较高，而且假阳猪肉中瘦肉精的检测性率低，与 GCMS 法相比样品不必衍生；缺点是样品处理时间长，检测过程烦琐、难于操作，需贵重仪器，在实际应用中受到一定的限制。 32.3 酶联免疫吸附法(ELISA） 4目前，检测 CLB 较高效的免疫分析技术是 ELISA 技术。早在 1992 年，Oriundi 就通过 ELISA 法对尿液和血清中的 兴奋剂残留进行直接分析，该方法既适于实验室大量样品的检测，也
12、适于屠宰场地少量样品的迅速检测。目前，英国的 Randox Laboratories Ltd 和德国的 rbiopharm 公司均开发出了检测肉品、饲料中 CLB 残留的 ELISA 试剂盒。中国在应用 EIA 检测 CLB 方面的研究起步晚，但近几年取得了明显的进展，目前已有几种试剂盒研制开发成功。2.3.1 测定原理“瘦肉精”（克仑特罗）竞争酶标免疫检测的基础是抗原抗体反应。酶联板的微孔包被有针对兔抗克仑特罗特异性抗体的羊抗体（第 2 抗体） 。加入兔抗克仑特罗特异性抗体（第 1 抗体）与第 2 抗体结合而被固定，洗涤后加入标准液或样品溶液与酶结合物（酶标记抗原） ，标准液或样品中的游离抗
13、原与酶标抗原竞争兔抗克仑特罗特异性抗体上有限的结合位点。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原，加入酶基质（过氧化脲）和发色剂（四甲基联苯胺）并孵育，结合到板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的底物。加酸终止反应后，颜色由蓝色转变为黄色。在单波长 450 纳米处测吸光度，吸收光强度与样品中的克仑特罗浓度成反比。2.3.2 样品制备取粉碎的肉样 5 克，与 25 毫升 50 mmol/L HCl 混合，振荡 1.5 小时。称 6克均质物，加入离心管中。1015条件下 4 000 转/ 分钟或更高的转速离心 15分钟。转移上清液到另 1 个离心管中，加 300 微升 1 摩尔/升氢氧化钠混合
14、 15分钟。加入 4 毫升 500 毫摩尔/升磷酸二氢钾缓冲液（ pH 值 3.0） ，简单混合，并在 4保存至少 1.5 小时或过夜。1015条件下 4 000 转/ 分钟或更高的转速离心 15 分钟。分离全部上清液，使其升至室温，然后用 C18 柱纯化。C18 柱纯化样品必须在室温条件下，并严格控制过柱时流速。用 3 毫升甲醇洗涤柱子，控制流速为 1 滴/秒。用 2 毫升洗涤液（ 50 毫摩尔/ 升磷酸二氢钾缓冲液 pH 值 3.0）洗涤柱子。将肉样的全部上清液进柱，控制流速为每 4 秒 1 滴。用 2 毫升洗涤液，洗涤柱子，流速为 1 滴/秒。用正压除去残留的流体并用空气或氮气吹 2 分
15、钟，干燥柱子。用 1 毫升甲醇洗脱样品，控制流速为每 4 秒 1 滴。在 5060并在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇溶剂。用 1 毫升蒸馏水溶解干燥的残留物，取 20 微升进行分析。取 10 克饲料样品，用 10 毫摩尔/升盐酸溶解，连续震荡 10 分钟，用滤纸过滤，在滤液中加入 120 微升 1 毫摩尔/升氢氧化钠进行中和，检查 pH 值，用氢氧化钠控制 pH 值在 6.57.5 之间，取上清液20 微升进行分析，稀释倍数为 25。2.3.3 测定步骤所有试剂及样品在开始检测前必须回升至室温，测定操作在 2024下进行。用盒中缓冲液以体积 110 的比例稀释实际用量的克仑特罗抗体浓缩液，稀释前
16、混匀抗体，不要猛烈振荡。取出试验需要数量的微孔板条，足够标准品猪肉中瘦肉精的检测和样品，标准品和样品做 2 个平行试验，记录标准品和样品的位置。剩余的微孔板条放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，28冷藏。每个微孔底部加 100 微升稀释后的抗体溶液，室温孵育微孔板 15 分钟，避免光线照射。孵育的同时进行酶标记物的稀释，洗板，甩出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打，直到纸上无明显水迹（拍打 3 次） ，以保证完全除去孔中的液体。用 250 微升蒸馏水充入孔中，再次甩掉微孔中液体，并在吸水纸上拍打，重复操作 2 次。加洗涤水的移液器管尖必须置于微孔上方约 0.5 厘米处打出洗涤水，避
17、免将板孔中的游离抗体带入洗涤水中。洗板后立即进行下步操作，不要让板孔干燥。加入 20 微升标准品和处理好的样品到各自的微孔底部，标准品和样品做 2 个平行实验。加入 100 微升稀释的酶标记物至微孔底部，轻轻震荡微孔，并在桌面上作圆周运动以混匀。移液器管尖不要接触到孔中的混合物，避免交叉污染。室温孵育微孔板 30 分钟，避免放置，尽可能每隔 10 分钟轻轻振荡 1 次，准备好酶基质，并注意避光放置。在洗板过程中加洗涤水的移液器置于微孔板上方 0.5 厘米处打出洗涤水，避免将板孔中的游离酶标记物带入洗涤水中。不要让板孔干燥，迅速加入 100 微升酶基质到每个孔中，操作步骤要迅速，避免反应时间相差
18、过长。移液器管尖不要接触微孔中的混合物，避免交叉污染。室温暗处孵育微孔板 15 分钟，暗处避光放置，同时，准备好反应停止液。每孔加入 100 微升反应停止液，混匀，60 分钟内用酶标仪测量 450 纳米处波长吸光度值2.3.4 结论ELISA 的优点是灵敏度高、操作简便、检测迅速、价格便宜；缺点是仍不能实现现场检测，而且假阳性率高。故而，ELISA 方法只是一种大范围的筛选方法，它不能起到定性和定量的作用，检测结果出现可疑，可以用其他检测方法进行定性和定量分析。2.4 毛细管电泳法（CE） 毛细管电泳法（CE）非常适用于难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析。优点是有很大的灵活性许
19、多分离参数如缓冲液的组成和 pH 值毛细管的类型以及所使用的电场的波形都可以调节，操作简便，所需样品量极少，一般只需几纳升。缺点是检测时间仍很长，不能满足在线检测，仪器复杂、缺乏配套的检测器3 CLB 检测技术的未来趋势和发展方向当前，造成盐酸克伦特罗屡禁不止的原因之一就是国内外检测 CLB 的方法、手段还不完善，还没有建立准确、迅速、方便、精确的检测方法。鉴于目前国内外检测 CLB 各种方法的进展情况以及 CLB 滥用及残留的严峻性，建立一种克服上述各种检测方法缺点的简便、快速、精确、可实现在线检测的 CLB 技术势在必行。生物传感器技术(Biosensor，BS) 和滴金免疫技术 (DIG
20、FA)是两种快速、高效的残留物分析技术，如能研究、开发运用到检测生物样品中 CLB 的残留可能会产生理想的效果。纳米材料是非常敏感的化学和生物传感器，固定有能选择性结合靶分子的猪肉中瘦肉精的检测生物探针的纳米传感器称为纳米生物传感器。它们能和生物芯片、免疫技术、标记技术等技术手段结合，从而使检测更加高效、简便。与液质联用分析克伦特罗的方法相比，基于碳纳米管的无标记电化学免疫传感器免除了样品分析前的固相萃取及纯化步骤，使得操作方法更简便。与 ELISA 法相比，该传感器同样具有样品处理简单及高能量的优点。此外，该传感器的方法很少受到基质效应的影响，或者至少比在 ELISA 方法中的影响小。 5纳
21、米金免疫标记技术，是蛋白质等高分子被吸附到纳米金颗粒表面的包被过程，由于金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。 5可以预见的是，在未来一定会有更加灵敏、快捷、方便的检测方法问世，从而使猪肉中瘦肉精的检测问题得到彻底解决。参考文献1 路平，肖肖，张衍海，王玉东，曲志娜，王娟，赵思俊，徐天刚，郑增忍，我国“瘦肉精”监管现状分析及对策建议，中国动物检疫，2011 年第 28 卷第4 期2 丁芳林，张朝辉，谭胜国，廖三赛，高效液相色谱法测定猪肉中的盐酸克伦特罗的研究，食品与机械，2007 年 10 月，第 23 卷第 5 期3 张清安 范学辉，动物性食品中盐酸克伦特罗( 瘦肉精) 残留危害及其检测方法研究进展，食品与发酵工业，2004 Vol. 30 No. 9 ( Total 201)4 柳显文，韩学颖，瘦肉精” 检测原理及操作步骤，养殖技术顾问，2012 年 1月5 蒋剑，盛毅，方智，罗薇，瘦肉精检测方法研究进展，草食家畜（季刊） ，2012 年 3 月第 1 期（总第 154 期）
