1、1绪论.生化分离技术：是指从含有目标产物的发酵液、酶反应液或动植物细胞培养液中，提取、精制并加工制成高纯度的、符合规定要求的各种生物技术产品的技术，又称为下游加工技术。生物技术产品：是指在生产过程应用微生物发酵技术、酶反应技术、动植物细胞培养技术等生化反应技术制得的产品。生物技术产品有哪些特点：生物技术产品有些是胞内产品，有些是胞外产物; 通常是由产物浓度很低的发酵液或培养液中提取的; 生物技术产品的稳定性差，易随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白质水解、自身水解等; 生物技术产品的生产多为分批操作，生物变异性大，各批发酵液或培养液不尽相同。生化分离技术按其分离原理可分为机械分离与传质
2、分离两大类。 生化分离过程主要包括哪几个方面？生化分离过程主要包括四个方面：原料液的预处理和固液分离；初步纯化（提取） ；高度纯化（精制） ；产品加工这四个步骤。第一章 固液分离技术排斥电位和产生吸附架桥作用的双重机制是絮凝的主要原因。发酵液的相对纯化方法有哪些？固液分离的目的：除去固体杂质，得到溶液；分离掉溶液获得固体。固液分离方法：过滤、沉降改善过滤性能的方法 工艺上一般采用如下方法：降低混合液粘度、增大被分离颗粒的粒度、加入助滤剂、提高离心机的转速或提高操作压力、增大真空度、降低滤饼层厚度、除去滤饼第二章 细胞破碎细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏微生物菌体的细胞壁或细胞膜
3、，释放其中的目标产物。细胞破碎的方法有哪些？各有何特点？一、球磨破碎 特点： 适用范围较广； 但有效能量利用率很低，设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计2较复杂。二、高压匀浆法 特点： 适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎， 不宜用于团状或丝状菌的破碎，易堵塞；由于操作中温度会升高，需对料液作冷却处理，保护目的产物活性。三、 超声破碎法 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多在实验室使用。 四、 酶溶法 特点：不同的菌体细胞由于细胞壁化学组成不同应选用不同的酶处理。优点：对设备的要求低，能耗小；抽提的
4、速率和收率高；产品的完整性好；对 pH 值和温度等外界条件要求低； 由于细胞壁被溶解，不残留碎片，有利于提纯。但是酶溶法受酶的费用限制。酶溶法的缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。五、化学破碎 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 通用性差； 时间长，效率低； 有些化学试剂有毒 。形成包含体的因素主要有以下几个方面： 重组蛋白的表达率过高，超过了细菌的正常代谢，由于细菌的蛋白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来； 由于合成速度太快，
5、以致没有足够时间进行肽链折叠，二硫键不能正确配对，导致重组蛋白溶解度变小；蛋白质的复性 复性是指变性的包涵体蛋白质在适当条件下使伸展的肽键形成特定三维结构，使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。 复性的方法：稀释复性、透析复性、超滤复性、层析柱复性、膨胀床吸附复性、温度跳跃式复性、双水相法、反胶团法3第 3 章 萃取和浸取技术.用溶剂从溶液中抽提物质叫液-液萃取，也称溶剂萃取。经典的液-液萃取指的是有机溶剂萃取. 液-液萃取过程机理主要有以下四种类型： (1) 简单分子萃取 (物理萃取) (2) 中性溶剂络合萃取 (3) 酸性阳离子交换萃取 (4) 离子络合萃取影响萃取操作的因素：a.
6、 温度 温度互溶性增大；温度产物稳定性提高，粘度增加，扩散性能减小。b. pH 值 影响分配系数，影响物质解离情况c. 溶媒比 溶媒比溶媒体积/萃取体积 溶媒比 萃取效果溶媒回收费用d. 盐分 无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中，另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。盐分分配系数带溶剂是指能和产物形成复合物，促使产物更易溶于有机溶剂相中，在一定条件下又要容易分解的物质。有机溶剂萃取的不足： 许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂 ； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。双水相萃取的优点： 使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成； 适合热敏
7、物质的提取，主要是胞内酶； 亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分都占大比例（8595） ，这样生物活性蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。影响双水相萃取的因素41、聚合物及其相对的分子量 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加。2. pH 的影响3.离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响4. 温度的影响超临界流体(SCF)萃取 是利用超临界流体作为萃取剂，对物质进行溶解和分离的过程。超临界流体(SCF)是处于临界温度和临界压力以上的非凝聚性的高密度流体。什么是反胶团？反胶团萃取的特点是什么？反胶团（reversed micelles）是表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基
8、团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。 反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能：具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能；在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。 反胶团萃取技术的突出优点有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；分离、浓缩可同时进行，过程简便；能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题；表面活性剂往往具有细胞破壁功效，可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；成本低，溶剂可反复使用等。第四章 沉淀技术影响蛋白质溶解度的外部因素主要有温度、pH、介电常数和离子强度。影响蛋白质溶解度的主要因素分成蛋白质性质和溶液
9、性质两类。球状蛋白质的表面多亲水基团由于水化层和双电层这两种稳定的因素，使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液。由于水化膜和双电子层的存在，蛋白质颗粒彼此不能接近，因而增加了蛋白质溶液的稳定性，阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来。 生化分离纯化中最常用的几种蛋白质的沉淀方法是：盐析法（中性盐沉淀） 、有机溶剂沉淀、选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀） 、等电点沉淀、有机聚5合物沉淀、聚电解质沉淀法、金属离子沉淀法。 （任选三种）影响蛋白质盐析沉淀的因素有哪些： 蛋白质的浓度 中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋
10、白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。 pH 值对盐析的影响 蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH 值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH 值常选在该蛋白质的等电点附近。 温度的影响 温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水
11、中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。有机溶剂沉淀法基本原理是什么？分析影响沉淀效果的因素。 主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如 20时水的介电常数为 80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是 24 和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
12、另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。温度 多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。样品浓度 低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样6品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。 pH 值 有机溶剂沉淀适宜的 pH 值，要选择在样品稳定的 pH 值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的 pH 值，
13、通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。 离子强度 离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过 5为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。有机溶剂沉淀法有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。第五章 吸附及离子交换什么是吸附？吸附的种类有哪些？利用吸附剂对液体或气体中某一(些)组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面。实质是溶质从液相或气相转移到吸附剂表面的过程。 物理吸附 吸附剂和吸附质之间的作用力是分子
14、间引力（范德华力） 。 化学吸附 利用吸附剂与吸附质之间的电子转移，生成化学键而实现物质的吸附。 交换吸附 吸附表面如为极性分子或离子所组成，则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层，这种吸附称为极性吸附。影响吸附的主要因素 吸附剂的性质 吸附质的性质 温度 溶液 pH 值 盐浓度 吸附物质的浓度与吸附剂量7 溶剂 活性炭吸附溶质的量在未达到平衡前一般随温度提高而增加，对相对分子质量大的化合物的吸附力大于相对分子质量小的化合物活性炭纤维与颗粒状活性炭相比，吸附与解吸速度快，工作吸附容量较大，外表面积大；固定床优点：流体在介质层中基本上呈平推流，返混小，柱效率高。 缺点：无法处理含颗粒的料液
15、，因会堵塞床层，造成压力降增大而最终使操作无法进行。流化床优点：压降小，可处理高黏度或固体颗粒的粗料液；不需要特殊吸附剂，设备操作简单。缺点：存在严重的返混，特别是高径比很小的流化床，使床层理论塔板数降低，吸附剂的利用率低。吸附操作中引起固定床过早出现“穿透” 现象的因素有哪些？如何处理？ 床层装填不合理，颗粒不均匀等，导致出现偏流现象，需重新对吸附剂床层进行装填。 操作过程不规范（如流速或压力突然变化） ，使床层均匀程度受到破坏，重新装填吸附剂后，严格按操作规程进行操作。 系统密闭性差，或操作不合理床层内出现气泡或分层现象。进行密闭性检查，消除漏气，消除气泡及分层后，再进行正常工艺操作。 料
16、液浓度过高，操作流速过大等。对待处理料液进行适当稀释，合理确定操作流速。离子交换技术：是根据某些溶质能解离为阳离子或阴离子的特性，利用离子交换剂与不同离子结合力强弱的差异，将溶质暂时交换到离子交换剂上，然后用合适的洗脱或再生剂将溶质离子交换下来，使溶质从原溶液中得到分离、浓缩或提纯的操作技术。利用离子交换技术进行分离的关键是离子交换剂。在生物产品中，分子通常较大，在树脂内部的扩散速度相对较慢，其离子交换速度常由内部扩散速度所控制。影响交换速度的因素 颗粒大小：愈小越快8 交联度：交联度小，交换速度快 温度：越高越快 离子化合价：化合价越高，交换越慢 离子大小：越小越快 搅拌速度：在一定程度上，
17、越大越快 溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快 被分离组分料液的性质： 溶液粘度越大，交换速度越小 树脂被污染的情况：不可逆吸附、不溶性的物质堵塞，离子交换容量下降，交换速度会下降； 水合离子半径：半径越小，亲和力越大； 离子化合价：高价离子易于被吸附； 溶液 pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量； 离子强度：越低越好； 交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少； 有机溶剂：使树脂对有机离子的选择性吸附降低，而容易吸附无机离子。 树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；强酸性阳离子
18、树脂 含有大量的强酸性基团 解离能力强，不受溶液 pH 变化的影响，用强酸进行再生处理弱酸性阳离子树脂 比强酸性树脂较易再生洗脱：离子交换完成后，将树脂吸附的物质释放出来重新转入溶液的过程称作洗脱。 洗脱是用亲和力更强的同性离子取代树脂上吸附的目的产物。 （a）改变溶液 pH 值（酸、碱） （b）改变溶液离子强度（盐) 洗脱剂应根据树脂和目的产物的性质来选择。 洗脱过程是交换的逆过程，洗脱条件应与交换条件相反，如吸附在酸性9条件下进行，洗脱应在碱性条件下进行；洗脱流速应低于交换时的流速。注意洗脱过程 pH 对产物稳定性的影响。 洗脱方式分为静态洗脱和动态洗脱。什么是树脂的毒化？树脂毒化的主要因
19、素有哪些？树脂失去交换性能后不能用一般的再生手段重获交换能力的现象称为树脂的毒化。毒化的因素主要有大分子有机物或沉淀物严重堵塞孔隙、活性基团脱落、生成不可逆化合物等，重金属离子也会对树脂毒化。对已毒化的树脂用常规方法处理后，再用酸、碱加热到 4050浸泡，以溶出难溶杂质；也可用有机溶剂加热浸泡处理。中毒的原因：主要有大分子有机物或沉淀物严重堵塞孔隙，中毒树脂往往颜色加深，甚至呈现棕色，乃至黑色；树脂的活性基团脱落；生成不可逆化合物或树脂与氧长期接触发生氧化等；负载离子的交换势极高，通常的洗脱剂或再生剂难以使其从活性基团上交换下来，使其不能与其它离子交换而失效；负载离子发生了变化。如交换了 Fe
20、3+的树脂，当用碱性溶液处理时，Fe3+发生水解，产生氢氧化铁凝胶，沉积于树脂孔隙中，造成堵塞。第六章 膜分离技术 膜的分类按膜分离过程分 微滤、超滤、纳滤、反渗透，按膜的材质分类无机膜、有机膜不宜采用膜技术的分离过程 具有相似分子量的化合物的分离 高渗透压料液的高倍浓缩适宜考虑膜技术的分离过程 有机物与无机盐的分离、多糖低聚糖与单糖等的分离 稀溶液的浓缩，热敏性料液的浓缩 分子量相差 10 倍以上物质的分离（超滤） 料液的澄清过滤、冷除菌、除热原膜的劣化是由于膜本身的不可逆转的质量变化而引起的膜性能的变化，造成的原因有如下三种：化学劣化、物理劣化、生物劣化。引起压密的主要因素是操作压力和温度
21、。压力越高，压密作用越大。10什么是浓差极化？简述浓差极化的危害及预防措施。 在膜分离过程中，由于水和小分子溶质透过膜，大分子溶质被截留而在膜表面处聚积，使得膜表面上被截留的大分子溶质浓度增大，高于主体中大分子溶质的浓度，这种现象称为浓差极化。浓差极化可使膜的传递性能及膜的处理能力迅速降低，还可缩短膜的使用寿命。主要表现为：渗透压升高，渗透通量降低；截留率降低；膜面上结垢，使膜孔阻塞，逐渐丧失透过能力。在生产实际中，要尽可能消除或减少浓差极化现象的发生。 浓差极化造成的渗透通量降低是可逆的，通过改变膜分离操作方式，提高料液流速来减轻浓差极化现象。错流操作时，料液与膜面平行流动，料液的流动可有效
22、防止和减少被截留物质在膜面上的沉积。流速增大，靠近膜面的浓度边界层厚度减小，将减轻浓差极化的影响，有利于维持较高的渗透通量。 第七章 色谱分离技术保留值 表示混合物中各组分在色谱柱中停留时间或将组分带出色谱柱所需流动相体积的数值，称为保留值。在定温定压条件下，当色谱分离过程达到平衡状态时，某种组分在固定相 S 和流动相 m 中含量（浓度）C 的比值，称为平衡系数 K（也可以是分配系数、依据生物高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合的原理，采用一定技术，把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相后，可把目的产物从混合物中分离出来，此中分离技术称为亲和层析。反相层析是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法。溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。 第八章 电泳技术
