1、MEKC 血样中药物.第 1 页原始文件沃尔夫冈Buchberger 马蒂亚斯 Ferdig 鲁道夫索默 翠 THANH VO 雷帕霉素在人体血液中的微量分析胶束电动色谱收稿日期：2004 年 3 月 16 日/日期：11 2004/5 月接受日期：2004 年5 月 18 号/发表时间：2004 年 7 月 20 日 施普林格出版社 2004 年摘要 毛细管电泳法与 UV 检测波长为 278 nm 的分析已经开发在人类的免疫抑制剂雷帕霉素（西罗莫司）血微克每升的水平低。 分离有在酸性载体电解质含有已取得十二烷基硫酸钠和 30（体积/体积）腈。为样品净化和富集，离线固固相萃取的步骤中使用的基于
2、二氧化硅的反相材料和毛细管聚焦技术采用。 后者允许注射增加扩大样本量，而不会过度带。虽然这种新方法是不敏感，比现有的质谱联用液相色谱程序法，它是完全适合常规分析的 RA-pamycin 血液中这种药物治疗的患者。最后，但并非最不重要的，低的成本使一个有吸引力的建立的方法替代。关键词雷帕霉素 胶束电动 血色谱 分析介绍雷帕霉素（西罗莫司）是三烯大环内酯类抗生素具有抗真菌，消炎，抗肿瘤和这是目前使用的免疫抑制特性用于预防器官移植排斥反应的反式种植园。 雷帕霉素的结构图给出。 1。雷怕霉素已被证明是阻止T 细胞活化和扩散以及激活 P70 S6 文 FK-506 结合激酶，表现出很强的结合蛋白质。 它
3、也抑制活性的蛋白质哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的，该功能蒸发散在促进肿瘤生长的信号转导通路。雷帕霉素结合到受体蛋白质（FKBP12），和的 rapamycin/FKBP12 复杂的结合mTOR 的并阻止 mTOR 的互动与目标蛋白质在这一信号通路。对于栽种的器官的患者是必不可少的监测雷帕霉素在他们的血液中的水平。 决定雷帕霉素在血液中的中断可以确定迄今已完成高效液相色谱紫外检测器1-4，最近由高效液相色谱法，连字符和质谱（MS）5-8。耦合的毛细管电泳（CE）电电喷 MS 的检测的非共价键受体配位体配合物之间的亲免素 FKBP12 和 Hsieh 等人已经描述了雷帕霉素。 9。 旁总是需
4、要去蛋白，样品制备净化和富集的步骤，这是主要管理固相萃取（SPE）。 KIR-chner 等。 10-14更换离线 SPE 一步通过柱，一上线提取切换。基于 HPLC 与雷帕霉素的现有方法紫外检测器可能会受到比较长的分析时间（40 分钟），这也可能导致过量的溶剂消费。 大约是定量限2 LG LA1 差，但由于峰分辨率矩阵往往阻碍了测定低浓度。采用高效液相色谱法的方法结合 MS 产量的定量限一个数量级低于用 UV 检测得到的那些。 在除了 这一优势，分析时间被降低约 15 分钟，因为质量选择性检测，并不需要矩阵组成的完整的解决方案，组件。 使用 MS的所有方法的缺点检测昂贵拉琴要求-tation
5、。W. Buchberger：M. Ferdig（）AE TDT 武分析化学研究所，约翰内斯开普勒大学林茨Altenbergerstrae69，4040，奥地利林茨 电子邮件：matthias.ferdig jku.atR.索默医学研究所与化学实验室诊断，瓦格纳 Jauregg 医院，瓦格纳Jauregg-WEG 15，4020 林茨，奥地利，肛门 Bioanal 化工（2004）380：68-71DOI 10.1007/s00216-004-2687-x第 2 页许多免疫抑制治疗药物监测 pressants 往往是做与免疫测定法，以保持每次分析的成本低。 不幸的是，没有免疫市售雷帕霉素15，
6、从而使可靠的分析仍然依赖于仪器分析分离技术。本文的目的是要表明，CE设备可以是一个有吸引力的替代品建立的 HPLC 方法，特别是电泳技术往往表现出这些不同的分离选择性，中遇到的色谱。 对于中性分析物雷帕霉素胶束电动色谱法（MEKC）可以被认为是合适的技术。 作为一个结果的比较普遍较低的灵敏度，行政长官会同行政会议伊森与HPLC，富集步骤是必要的。 在这项工作扫描法（毛细管 preconcen 加以登记）被用在除了强制性 SPE 诉 dure 实现适当的量化限制。扫富集技术为 CE据报道由几位作者的各种应用，其中包括生物体液中的药物16-23。在目前的工作进行分析的样品预处理血液中的雷帕霉素（蛋
7、白质沉淀），是基于目前使用的方法在常规的 HPLC 分析7。实验的仪器仪表所有实验均在一个电泳 ATI 的 UNICAM 水晶 CE 系统（ATI UNICAM，才可桥，英国）。 一个 100 TSP 光谱。可变 UV / VIS CE 检测器（热分离产品，加利福尼亚州的圣何塞，检测器中的美国）用氘灯担任。检测波长为 278 nm。 该系统是配备的熔凝硅石毛细管 75 厘米总长度（60厘米有效长度从入口到检测窗口），75 流明 ID（Polymicro 科技，凤凰城，亚利桑那州，美国）。 毛细管预处理用 1 M 氢氧化钠 30 分钟，随后与水和 30 分钟的 10 分钟与载波电 LYTE。 之
8、后，没有更多的预处理是必要的。从检测器的信号被数字化和亲通过变色龙软件处理过的（戴安，短暂时间有阳光淡水河谷，CA，USA）。质谱检测是在四 rupole系统 5989B（安捷伦）使用大气气压电离（空气辅助电）接口59987A（安捷伦）配备的 RF 只六极（分析“布兰福德，布兰福德，CT，USA）。对于 SPE，Bond Elut 的 C18-OH 墨盒的（100 毫克，1 毫升）从 Varian 公司（Palo Alto，CA，USA）得到的使用。化学制品（试剂级）磷酸（85），硫酸锌和购自 Merck 氢氧化钾（Darmstadt，德国）。 乙腈，甲醇（包括 HPLC 梯度级），乙酸乙酯（
9、超残分析的质量）和异丙醇（ACS 贝克分析质量）JT 贝克（芬特尔，荷兰）。 环己烷（puriss.）和十二烷基硫酸钠（SDS）（MicroSelect）由 Fluka 提供（Buchs，瑞士）。 雷帕霉素所提供的山德士（Kundl，奥地利）。18 MW 水的 Milli-Q 水净化系统（Millipore 公司，贝德福德，MA，USA）用于整个工作。标准和样品的制备在甲醇制备雷帕霉素 A 股的解决方案在 100 毫克 L 的浓度 A1。 标准的解决方案为扣球，得到了进一步的稀释甲醇。 所有溶液均存储在20。校准样品的制备通过混合适当体积的 EDTA 标准溶液处理过的全血（空白样品）达到 CO
10、N 对中范围 2.5-50 LG LA1。 校准曲线基于峰面积。样品净化，1 毫升的 EDTA 处理的全血液充分混合，用 2 毫升的蛋白质预降水的解决方案，包括 0.1 M 硫酸锌 4 在方法 anol /水（30:70，体积/体积）。 后，离心分离（4,000 rpm 下，10 分钟），2 毫升稀释的液体层 20 毫升的水，然后将其进行 SPE。固相萃取小柱空调用乙酸乙酯，甲醇和水。 后应用图。 1 雷帕霉素的化学结构69第 3 页重刑的脱蛋白质的样品，洗涤步骤甲醇/水（50:50，体积/体积）的 2毫升和 2 毫升水被列入。 干燥后的 SPE 材料施加真空，进行洗脱，用1.5 毫升异丙醇/
11、环己烷（50:50，体积/体积）。 “洗脱液蒸发至干，通过使用流氮和重组 50 L L 50 mm（高）3PO4 的 pH 值2.0/methanol（80:20，体积/体积）。 此溶液用于注射入的 CE 仪器。分离条件SDS 溶解在载体电解质30 毫升 50 mm（高）3PO4pH 为 2.0 和 15 mL 乙腈。最后，它被填充至50 mL 水。 在 SDS 在所得溶液中的浓度为 80 mM 的。 为压注射液 10千帕时间为 150 秒。分离电压保持在20 千伏。结果与讨论胶束电动色谱法在载波电trolytes 含有 SDS 作为阴离子性伪静止相原来是一个适当的技术中性分析物雷帕霉素。 优
12、化的分离 TION 需要使用的有机改性剂，如乙腈腈或甲醇在载体电解质实现雷帕霉素和基体之间的合适的解决方案组件。 另一方面，乙腈浓度 trations 高于 10（体积/体积）和甲醇导致较高的临界胶束浓度，使高在载体电解质的表面活性剂的浓度必须使用24，25。 这导致在不利中的电流的折痕。 因此，在本工作 SDS 浓度定为 80 毫米，有机溶剂的浓度，从 5 变化到 40（体积/体积）。甲醇，乙腈和二者的混合物有机改性剂的载体电解质测试。通常，灵敏度降低观察增加量的有机溶剂，尤其是当用甲醇。 这主要是由于更广泛的峰形。 获得最好的结果是与载体电解液含有 30乙腈（体积/体积）。注射体积通常用在
13、 CE（例如应用为 5 秒的 5 千帕）的压力，是不适合用于跟踪在低微克每升范围的分析，即使是在结合固相萃取富集步骤。灵敏度的改进，通过增加注射体积需要一些聚焦在毛细管的影响进气口保持窄峰宽度。 另外，在本情况下，更高的灵敏度，可以实现通过使用毛细管预富集的基础上搜索技术在注射过程中的步骤。 的样品溶液注入水动力在 10 kPa 的时间为 150 秒。当施加电压时，微胶粒的背景通过电解质迁移的长采样插件 COL-lecting 雷帕霉素的分子和集中在样品和背景之间的交界处，电 trolyte。 增加扫描法（10 千帕，150 秒）由 50 相对的一个因素的法线的峰值高度- MEKC 注射 5
14、千帕，（5 秒）。 根据哈根泊肃叶定律，这个因素应该是60。 这种差异理论和实验之间可以归因于更广泛的峰形在箱子扫高科技多米尼克。 最终的堆叠上的贡献毛细管预富集研究样品注入的离子强度的 5 倍比载波电解质。 在这种情况下的峰值表现出略微低高度，表示只有可以忽略不计的叠加效应。雷帕霉素的疏水性高的字符使得它非常适合富集 aque 项的样品基质如血 SPE C18 改性二氧化硅。 即使是一个洗涤步骤，用甲醇/水（50:50，V / V）不会降低回收率。对于洗脱，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，乙腈和环己烷/异丙醇（50:50，体积/体积），调查门控。 最后产生了最佳的回收率（89）。典型的空白人体血液
15、色谱 5 LG L 样品和一个人的血液样品加标 A1 雷帕霉素示于图。2。 比较两个色谱图，表明两个信号应该认为：主要源于雷帕霉素;小的雷帕霉素降解的产品，这被证明的样品制备过程中要形成步骤。的降解是不损害到分析的过程，因为其程度在相对 于主在整个浓度的化合物是恒定的在这项工作中的研究范围。 这降解产品 UCT 被证明是开环的雷帕霉素分子。图。 2A，B 的色谱图的一个空白的血液样品（a）和血液样品中添加 5 LG LA1 雷帕霉素（b）中 熔融石英毛细管 升 合计= 75 厘米 ， LEFF= 60 厘米，ID = 75 流明;载体电解质acetonitrile/water/115 mM 的
16、 SDS，50 mm（高）3PO4，pH 为2.0（30:10:60，体积/体积/体积），在 10 千帕的 2.5 分钟的高压注射;分离电压20 千伏，UV 检测波长为 278 nm70第 4 页的开环过程中可诱导的治疗雷帕霉素在碱性介质中，在温和的温度。“这降解产物的身份证明 CE-ESI-MS 法醋酸铵为载体的电 trolyte。线性验证之间的范围中 2.5 和 LG L 50A1 样品中添加的血液样本，以及与标准的解决方案。 相关系数为 0.999。 方法的重复性进行了调查与10 血液样本含雷帕霉素在一个水平 5 LG LA1 给予低于 6的相对标准偏差。 整个结果验证总结于表 1。结论
17、本文的结果表明，CE 具有足够的鲁棒性和是一个有吸引力的技术用于分析在血液中的浓度的雷帕霉素的能力 trations 在低微克每升围。抽屉式中后卫相比，HPLC-MS 的时间越长分析的时间和较低的灵敏度（约一个数量级）。 尽管如此，这样的新的 CE 的灵敏度的方法是足够的，因为有关的浓度雷帕霉素在血液中是 LG L 3 和 10 之间的A1。 CE 还提供复用的可能性，因此平行多达 96 个样品的分析，可以做到与仪器MENTS 已经市售。 这样平行分析可以提高样品通量 enor 的，mously，但不会是可行的用 HPLC。 低消耗的有机溶剂和较低的拉琴 tation 成本是所提出的 CE 的
18、进一步的优点 HPLC-MS 法。 一般情况下，行政长官可能是结果 HPLC 方法的选择，如果必须 con-坚定一个额外的分析技术展示不同的分离选择性。参考文献1。 Ferron 的 GM，康威 WD，：Jusko WJ（1997）J Chromatogr 乙703:243-2512。 那不勒斯 KL，Kahan 的 BD（1994）J Chromatogr 乙 654:111-1203。 CP，Scatina JA，Sisenwine SF（1995）J LIQ 的 Chrom18:1801-18084。 斯文森 JO，C，SAWE J（1997）进一步药物 monit 的 Brattstr
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