1、考马斯亮蓝法（Bradford)测蛋白浓度考马斯亮兰法：一种蛋白定量法具体操作步骤:（一）实验原理双缩脲法（Biuret 法）和 Folin酚试剂法（Lowry 法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由 Bradford 建立的考马斯亮兰法（Bradford 法） ，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰 G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax） ，由465nm 变为595nm，溶液的颜色也由
2、棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm 下测定的吸光度值 A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford 法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，
3、颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g 球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N 的 NaOH。 （如同0.1N的酸干扰 Lowary 法
4、一样） 。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 Beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml 和0.1mg/ml 的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰 G250染料试剂：称100mg 考马斯亮兰 G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入100ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加
5、入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml 的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml 考马斯亮兰 G250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除） 。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。考马斯亮兰法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质(1.0mg/ml)0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0.0考马斯亮蓝G2
6、50试剂5 5 5 5 5 5 5每管中的蛋白质量（mg）0光吸收值（A595）未知蛋白(约1.0mg/ml)0.04 0.06 0.1（2）加完试剂25分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm 处的光吸收值 A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O 加5.0mlG 250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色） ，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值 A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的 A5
7、95值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg 牛血清蛋白/ml 溶液的 A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml 或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml 或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝 G250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm 的光吸收值。0.05mg 牛血清蛋白/ml 溶液的 A595约为0.29。 Bradford 法是最常用的蛋白质快速定量方法。Coomassie brilliant blue G-250与蛋白质结合使染料的最大吸收峰由465 nm 变为595 nm，溶液的颜色由棕色变为兰色，595nm 波长下吸光度值与蛋白含量成正比。灵敏度比 Lowry 法高4倍，与 BCA 法相当。
