1、 1 第十八章 血细胞分离技术（Separation technique of the blood cell）一、原理在体外进行细胞免疫检测时，首先必须进行淋巴细胞的分离。分离淋巴细胞的方法很多，但不管采用哪种方法，均要求分离的淋巴细胞纯度高、产量多，而且不丧失活性，同时也要求分离技术简单、操作方便。外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一，两类细胞的大小和密度不同，其沉降速度也就不同。红细胞的自然沉降率较快，加入高分子量的聚合物，如明胶、右旋糖酐等还可以加速其凝聚。利用自然沉降法、密度梯度离心法或二者结合，可以将淋巴细胞从血液中分离出来。这种分离出的淋巴细胞一般包括单核细胞。除去单核
2、细胞，可以利用单核细胞的吸附功能，如铁颗粒、玻璃面或尼龙网等，除去（或分离）单核细胞，从而提纯淋巴细胞。二、采血（一）材料与试剂1抗凝剂（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其钠盐或钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，从而阻止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为 1 000U/ml，市售肝素多为 100U126Umg。（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一种螯合剂。用生理盐水配制成 4的溶液备用。 2 （3）阿氏液（Alsever 液） ，配方如下：枸橼酸钠（Na 3C6H5O75H2O） 0.80g枸橼酸 0.0325g葡萄糖 2.05g氯化钠 0.42gH2O 加
3、至 100.00ml混匀溶解后，114.3高压蒸汽灭菌 10min 备用。阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂，又含有细胞生存的营养，所以它既可做抗凝剂，又可做血细胞的保存液。2针头 根据不同动物和采血部位，采用不同型号的针头，用前必须灭菌或消毒。3采血容器 注射器或三角瓶等。4采血动物。（二）操作方法1采血法 各种动物采血方法不一。马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。2抗凝 采集血液最关键的问题是抗凝，采用什么方法进行抗凝，则根据实验
4、的要求和条件而定。最常用的方法如下：（1）肝素抗凝：采血时，使每 ml 血液含 15U20U 肝素即可。计算采集的血液量，按 1 000U/ml 的量加入肝素，直接放入采血容器中，采血时，边采血边轻轻摇动，使抗凝剂和血液混匀。对于采少量的血液或小动物采血，可直接用注射器抽取一定量的肝素液，再采血直接抗凝。（2）EDTA 抗凝：采血前，用灭菌生理盐水将 EDTA 配制成 4溶液，然后按预采血液的量，以每 ml 血液加入 1mg2mg 的 EDTA 的液体量于采血容器内。采血，并不断摇动采血容器，使之混匀。（3）玻璃珠法：预先将适量的玻璃珠（根据采血量多少而定）清洗后，装入采血容器中，灭菌后备用。
5、采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但对淋巴细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。（4）阿氏液采血：以阿氏液和采血量以 11 比例采集血液，边采边轻轻摇动采血瓶，使之混匀。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于红细胞的保存。一般在 4条件下，阿氏液中保存的红细胞 2 周其活性和特性不变。 3 三、红细胞的分离技术（一）材料与试剂1肝素等抗凝剂23明胶液 取明胶 3g，溶于 0.9灭菌盐水 100ml 中，114.3灭菌10min，冷却后 4冰箱保存。临用时，37预热 10min。3阿氏液（二）操作方法1采血抗凝，即为红细胞。由
6、于红细胞与白细胞的比例相差悬殊，一般白细胞混杂在其中，忽略不计。2根据红细胞的用途，可做进一步的处理。如计算红细胞，可直接稀释计数。如需做补体结合反应，或其它溶红细胞反应，则需将红细胞进行充分的清洗，以除去附着在红细胞膜表面的血浆。一般用等渗的稀释液连续清洗，2 000r/min 离心 10min，重复 34 次。3如需储藏备用，则以阿氏液做抗凝剂采血，混匀后置 4冰箱保存，可保存 2 周，其活性尚可。四、淋巴细胞的分离技术（一）材料与试剂1淋巴细胞分层液有两种：（1）聚蔗糖泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名 Ficoll，分子量 400 000，多配制成
7、401（W/V ）水溶液，也有干粉出售。应用时，用蒸馏水配制 9溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名 Vrografin，结构式为 3，5二乙酰氨基 2，4，6 三碘苯甲酸 1去氧甲氨基山梨醇。含量为60或 75，每安瓶为 20ml 装，常用于人的脏器造影。应用时，取 60泛影葡胺原液 20ml，加双蒸馏水 15.38ml，即为 33.9泛影葡胺。 4 1.0770.001 聚蔗糖泛影葡胺的配制：9聚蔗糖液 24 份33.9泛影葡胺液 10 份混合即可。必要时，可测比重。需要备用，可用 G5 漏斗过滤除菌或 114.3高压灭菌 15min，4保存。一般可保存
8、 3 个月。如要配制不同比例的分层液，可按下列公式计算：式中 dm 为分层液的比重，d 1 和 d2 分别为 9聚蔗糖和 33.9泛影葡胺的比重，V 1 和 V2 分别为它们的体积。如需配制 1.077 比重的聚蔗糖 泛影葡胺的分层液，则 9的聚蔗糖和 33.9的泛影葡胺的比例应为 10046.3。（2）泛影葡胺右旋糖酐（dextran）液34泛影葡胺液 10 份60右旋糖酐液 12.5 份混合，即为比重 1.071.09 的分层液。分装于棕色瓶中，4冰箱保存备用。2 3的明胶液 称取明胶 3g，溶于 0.9的灭菌生理盐水，终体积100ml，114.3高压灭菌 10min，冷却后 4冰箱保存，
9、临用时 37预热 10min。3Hanks 液。（二）操作方法1取抗凝血，自然沉降，如是马属动物的血液，可直接直立试管架上，让其自然沉降 1h，取上层血浆。如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3明胶液，混匀后让其自然沉降，1h 后取上层血浆。22 000r/min 离心 10min，弃上清。3沉淀用 Hanks 液混悬后，再 2 000r/min 离心 10min。4重复步骤 3 一次，再用细胞营养液将白细胞制成悬液。此液含有整个白细胞群，包括粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和部分红细胞。可供白细胞计数用。5取 2ml 细胞分层液于离心管内，同时用毛细吸管吸取约 2ml 的血浆（自然沉降
10、1h 的上层血浆）轻轻加入分层液上，直接加抗凝血也可。6以水平转子离心机 2 000r/min 离心 20min。离心后，可见分成多层，最下层是红细胞，中间层是分层液，最上层是血浆。在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白色层，即为单个核细胞层。7用毛细吸管插入到单个核细胞层并吸取该层，放入另一试管中。 5 8以 Hanks 液洗涤、离心，最后配制成适当的白细胞浓度。必要时可计数。（三）注意事项1血浆或血液加入分层液中时要小心，缓慢不要打乱液层、不要摇动。也可以将分层液加入到血浆的上层。2保持淋巴细胞的活性是非常重要的，所以一般情况下，是现采血，马上进行分离。3经过分层液分离的淋巴细胞层，实际上
11、是单个核细胞层，包括单核细胞，不包括粒细胞。欲分离出纯的淋巴细胞，则按下法除去单核细胞，或收获单核细胞。五、单核细胞分离技术（一）铁粉吸附法1材料及试剂（1）铁粉或羰基铁粉（Atomergic chemetals）99的纯度，颗粒小于60m（Goodfellow Metals） 。（2）强磁铁（马蹄形） 。（3）一块小棒状磁铁（约 1cm 长） 。（4）毛细吸管等。2操作方法（1）称取一定量的铁粉，一般为 10g，用 100ml 生理盐水洗涤 4 次，去除任何可溶性有毒物质。在倒去盐水时，用强磁铁吸住铁粉。（2）用 50ml 生理盐水混悬铁粉。摇匀后，分装于 10 个瓶中，包扎瓶口，121灭菌
12、 20min，拿出后立即轻轻摇匀，防止铁粉结块，储藏备用。（3）临用前，倒去瓶中的生理盐水，加入适量的单个核细胞悬液（3ml5ml，细胞总数为 8107 个瓶） 。37温育 45min，中间不时晃动，使铁粉悬浮起来。（4）加入一块小磁铁棒于瓶中，让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的细胞。（5）倒出悬液，此悬液主要是淋巴细胞，离心，收集。（6）在铁粉瓶内倒入一定量的 Hanks 液，用力振摇后，以强磁铁吸附，几 6 分钟后，倒出液体。（7）2 000r/min 离心液体，管底即为单核细胞。（二）玻璃板吸附法将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内，置 37 30 min40min，用毛细吸管轻轻吸取
13、悬液，即为淋巴细胞。用适量的 Hanks 液冲洗平皿，收获即为单核细胞悬液。六、 T 淋巴细胞的分离技术（一）原理 混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B 细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数 T 细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含 T 细胞群的有效方法。（二）材料及试剂1尼龙毛（Femwall Laboratories,LP1 Leukoqak leukocyte Filters ） 。2烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。3装填尼龙毛柱，一次性注射器。4取自然沉降的上层血浆，过聚蔗糖泛影葡胺分层液后，获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。（三）操作方法1尼龙毛的清洗
14、与干燥（1）戴上已经洗去滑石粉的一次性手套，将尼龙毛（1 包或 2 包，每包35g）放入烧杯中，加入蒸馏水或去离子水，用铝箔盖上烧杯并煮沸约 10min。（2）冷却至常温，倒入漏斗内，使水滴干。（3）重复（1） 、 （2）步骤 6 次。（4）将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内，37温箱干燥 23 天后，贮藏在带盖的方盘内。2装尼龙毛柱（1）取 50ml 玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器头上套一段带夹子的胶管。（2）将尼龙毛梳理，并适当折叠，以适应注射器的直径，填入注射器内，约 7 20ml 的体积。（3）将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好，高压灭菌。3细胞分离（1）将注射器固定在支架上，倒入
15、37的细胞培养液，关闭阀门一定时间，然后打开阀门，放掉细胞培养液，以清洗几次尼龙毛，关上阀门。（2）将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度，约5.00107 个细胞ml。（3）将细胞液倒入注射器内，使之没过尼龙毛柱。盖上注射器，37温育45min至 1h。（4）打开下口，缓慢放流（1 滴min） ，收集于离心管中。（5）离心，即获所需的 T 淋巴细胞。（6）关闭注射器下口，于注射器内加入 0.85冰冷生理盐水，振荡，并套上注射器芯，打开下口，使劲推出注射器内液体，即获得粘附于尼龙毛上的 B 淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。（四）注意事项1此种分离法，T 淋巴细胞也常有一部分被吸附，吸附的多少与尼龙毛的质量有关，与装柱的松紧也有关系。2此法的 T 淋巴细胞的回收率约 2030。3用过的尼龙毛可回收，以盐水洗涤，然后浸入 0.1Mol/L 的 HCl 中过夜，然后再同前法清洗。
