1、第四十九章基因治疗药物基因治疗(gene thepy)是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。通过一定基因转移载体将正常或有治疗价值的目的基因或核酸分子导靶细胞，从而达到防治疾病的效果 c，基因治疗药物或基因药物通常指携带目的基因或核酸分子的载体或遗传修饰的体细胞，而基因工程药物(g 蚰毋ghg)是指有治疗价值的目的基因导细菌、酵母或哺乳动物细胞或转基因动植物等宿主细胞进行表达并经分离和纯化获得蛋白质产物(包括活性蛋白质和多肚药物、重组疫苗及单克隆抗体)。白 1990 年 9 月世界上第 1 例腺昔脱氟酶缺乏所致的重症联台免疫缺陷病患者接受基因治疗临床试验 u 来，基因治疗基础和临床研究取得了巨
2、大进展，适应证从先天性遗传病扩展至恶性肿瘤等获得性疾病。基因治疗药物重组腺病毒一p53(recombined p53 adenoids)和重组人 5 型朦病毒(一mbi dType-5 adeno14101)在我国正式批准上市。基因治疗作为一种垒新的治疗手段，尽管在有效性、安全性和可操作性等方面仍面 l 临着诸多棘手问题，但随着人类基因组计划(hugenomic project，I-IGP)的完成和后基因组研究的开展，以及小干涉 RJqA($malltnterfenng RNA，siRNA)等生物技术的应用基因治疗有望取得突破性进展。第一节基因治疗概论(一)基因治疗类型基因治疗接基因操作方式分
3、为两类一类为基因增强(g跏 gmnon)和基因失活(辨眦lnaon)。基因增强叉称基因修饰，将目的基因导病变靶细胞或其他靶细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强，目前基因治疗多采用这种方式。基因失活义称为基因封闭如利用反义(anse)寡核苷酸特异地封闭基因表达，抑制特定基因的表达；通过核酶(nb。zyme)在细胞内特异性降解靶基因的转录产物，控制特定基因的表达；应用 stRNA 使基因沉默从而调节特定蛋白功能。另，类为基因修正(辨一)和基因置换(窖 eePl 托nt)，将缺陷基因的异常序列进行矫正或对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重
4、组(h10 刚呲 omhlnat)即基因打靶(g蝴恤 g)技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，M 而使缺陷基因在 J 泉位特异性修复由于日前同源重组频率太低而无法用于临床。基因治疗按靶细胞类型 x 可分为生殖细胞(se 枷一ne c elI)基因治疗和体细胞(删一e11)基因治疗。广义的生殖细胞基固治疗以精于、9 日于、早期胚胎细胞作为治疗对象。从理论上讲，直接对生殖细胞进行基因治疗是可行的并能彻底根除遗传病，但由于当前基因治疗拉沭还不成熟，以及涉殛一系列伦理学问题，生殖细胞基因治疗仍属禁区。在现有的条件下，基因治疗仅限于悻细胞，基因型的改变只限某一类体纲胞，其影响也只限某个体的当代。f
5、 二基因治疗条件基因治疗是通过外源性遗传物质(目的基因)导人人体靶细胞而治疗疾病的方法。因此目的基因的准备、靶细胞的选择以及基因转移的途径是基因治疗的必备条件。1 目的基因的准备基因治疗首先必须获得目的基因，并对表达调控进行详细研究。根据基因治疗不同需要，目的基因可以选择互补 DMA(c。 【Ipl“qDNA，cDNA)t 也可以选样染色体基因组 DNA(gmlc DNA)；可以是人体正常的基因，也可队是人体基因组所不存在的野生型基因。供转移的目的基因必须保持结构及功能的完整性以保证在靶细胞中正常表迭其功能。目的基因本身一般不含启动子等调控序列，导人靶细胞后很难进行表达。田此，必须将目的基因重
6、组于含有调控序列的质粒或病毒的表达载悼唧一)的合适位置，再导细胞，在特定调控序列指导下进行表达。2 靶细胞的选择根据基因治疗嗣的选择不同的俸细胞作为靶细胞。生殖细胞作为基因转移的靶细胞倥在动物(转基因动物)中进行，用来生产治疗药物或建立疾病动物模型等， ，基因治疗的合适靶细胞应容易从体内取出和回输能在体外增殖并经得起体外基因操作，能高效表达外源基因以及具有较长的存活期。目前常用的靶细胞有骨髓干细胞(c e11)、肝细胞、成纤维细胞、淋巴细胞肿瘤细胞、肌细胞和内皮细胞等 n 近年来已越来越多地将卅繇基因直接导入体内相应的靶组织器官，如脑、肺、肝及骨骼肌等。3 基因治疗的途径按不同疾病和导人基因的
7、不同性质予以选择 u科 wm 途径：这是指将含外源基因的载体在体外导人人体自身或异体细胞(或异种细胞)，这种细胞被称为“基因工程化的细胞” ，经体外细胞扩增后，输回人体。这种方法易干操作，由于细胞在扩增过程中，对外源的添加物质经大量稀释井易于清除；同时，人体细胞尤其是自体细胞，加工后应用于人体自身，一般来说易于解决安全性问题。但在l、lk 化方面，除载体系统外小易形成规模，而且必须有固定的临床基地。叫基因转移选径比较经典、安全而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度太，不容易推广；m 订啪途径；这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，原位(m Hfu)或直接导人体内。这种载体可以是病毒
8、型或非病毒型，甚至是裸 DNA。这种方式的导人无疑有利 lf 大规模工业生产。但是，对这种方式导人的治疗基因以及其载体必须证明其安全性，而且导 t 凡悻内之后必须能进 A 靶细胞，有效地表达井达到治疗目的。m 订 vo 基因转移途径操作简便，类似传统给药方法容易推广，这类基因转移途径目前虽然尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫排斥及安全性等一系列问题，但它是基因转移的方向，只有珊 wyo 基因转移途径成熟了，基因治疗才能真正走向 l 临床同时意味着基因药物时代的全面到来。第二节基因转移方法基因治疗应根据不同的靶细胞和细胞基因转移系统的特点来选择不同的转移方法。例如，处于分裂相的肿瘤细胞可用逆转录
9、病毒载体转移系统；肌肉组织由于其特殊的结构特别适用于裸 I)N直接注射法等。理想的基因治疗载体应具有以下特点：必须易于高滴度大规楼商品化生产；载体的持续稳定性：即在一定耐期内能够持续表选或者精确地调控遗传物质；载体的免疫惰性：载体成分在导人后不搬活宿主的免疫反应；载体的组织靶向性：即载体能定向地进人特定的细胞类型；载体对导入的遗传物质的太小没有限制；载体带有合适的调控序列，可以有效地转导、调节和表达外豫遗传物质；载体在细胞分裂中完成分裂和分泌，或者整台到靶细胞染色体特异性基因位点上，以避免对宿主染色体及生理条件下内源基因调节区域的随机整合，载体对分裂和来分裂细胞的感染：大量细胞(如神经元。肝细
10、胞和肌细胞)是分裂后期细胞所以需要能够有效地转人非分裂细胞的载体。 ，不同类型的载体具有不同特点，现在还没有载体能达到所有的要求。目前基因转移方法大体分为非病毒介导和病毒介导两大类。前者包括脂质体介导法、受体介导击、裸 DNA 直接注射法等理化方法，后者包括以逆转录病毒载体腺相差病毒载体、慢病毒载体为代表等整合型载体和腺病毒为代表非整台型载体介导的生物方法。第三节基因治疗应用I 一)遗传病基因治疗遗传病是遗传物质(DNA)发生变化而引起的疾病，分为单基因病、多基因病和染色体病。现已发现的遗传病有 6457 种，绝大多数缺乏有效治疗手段。基因治疗最初设想是将具有正常功能的外源基因导遗传病患者的细
11、胞里取代或补充缺陷基因使其恢复正常功能而达到治疗遗传崭的目的。目前遗传病基因治疗的首选病例是某些单基因遗传病，这是因为其缺损的基因已确定，时致病基因的结构、功能(如定位、测序、调控)及蛋白质产物等都有较深入的研究和认识。迄今已有 12 种遗传性疾病，如腺苷脱氨酶(ad蛐 e d“eADA)缺乏导致重症联合免疫缺陷综合征(scID)、家族性高胆固醇血症(6rdld hyp。虻hol】aFH)又称高 B 一脂蛋白血症、囊性纤维化(c“dc 邱，cF)、Gher 病(戈谢病)、血友病(hefnllphilia)和地中海贫血(halas mia)等。尽管生殖细胞基因治疗是根治遗传病的最终目标，但由于目
12、前基因治疗理论和技术不完备以及伦理学问题，遗传病基因治疔仍限于体细胞。I 二)恶性肿瘤基因治疗从临床角度和肿瘤发病机制来看。理想的肿瘤基因治疗模式无非是将有突变的基因修复或用正常的基因替换即病因性基因治疗。但是，就目前的技术手段实际上尚难以实现。现在常用的基因治疗策略主要包括免疫性基因治疗、溶瘤腺病毒基因治疗、自杀基因治疗和辅助性基因治疗。1 免疫性基因治疗由于在肿瘤的发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿幅细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿癌细胞本身的免疫性不强(如 MHc 表达不足)，也可蔼【于抗原递呈细胞(AP(：)不能提供足够的共刺激信号(如 B7)，或者机体免疫因子分泌不足等。因
13、此可以通过“下四种方法纠正机体肿瘤免疫的耐受状态：Llj 将某些细胞因子(如 IL 一2、TNFa 等)的基因转染到机体免疫细胞(如 TIL、IAK 细胞及细胞毒淋巴细胞)中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力。这些细胞因子的基因治疗在定程度卜克服了细胞因于注射疔去需反复多次应用副作用严重等缺点，疗效也有提高。肿瘤免疫细胞因子基因治疗因其简单、有效、安全，已成为肿瘤免疫基因治疗研究的最常用方法；由于肿瘤细胞存在功能性 MHc I 类抗原和(或)其刺激信号表迭不足，可以将一些与免痤识别有关的基因(如 HL_、B7 等)转染到体外培养的肿瘤细胞，经钴照射灭活其致瘤性后再植肿埔患者体内；或
14、者将表达 HLB7 的病毒载体或质粒 DNA 与脂质件复台物直接性射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应：制备肿瘤 DNA 瘤苗即将编码特异抗原的基因直接注人体，通过其在机体内的表达从而可以激发机体对编码抗原的免疫反应。如应用癌胚抗原(cEA)制备的肿瘤 DNA 瘤苗在宴验中显示出一定的效果；树突状细胞(ddri ceuDc)是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，广泛分布于除脑以外的全身各脏器，能摄取、加工抗原，表达高水平 MHC：分子、共刺激分子、黏附分子，并分泌高水平 Thl 型细胞园子 lL 一 12，具有很强的抗原提呈能力，可有效激发 T 淋巴细胞应答。用
15、肿瘤抗原编码基因修饰 DC、肿瘤 mRNA 刺激 DC：、细胞因子修饰 Dc 等方珐增强 Dc 的抗原提里能力是近来肿瘤免疫基因治疗研究的热点。2 病因性基因治疗 目前肿瘤病因性基因治疗主要针对癌基因和抑蝎基因，其策略是抑制、阻断癌基因的表达或者替代、恢复抑癌基因的功能。针对癌基因治疗：采用反义寡核苷酸、核酶和 sRNA 抑制癌基因的表达将有可能使肿瘤的基图表达调控回复到正常并使细胞重新分化或者诱发其凋亡(印。pt0 螂)。由于转录是遗传信息放大的过程，因此对于癌基因的表达抑制来说更为有效，该方法卫称反基因(an“萨 ne)策略；针对抑癌基因治疗：替代或恢复由于缺失或突变而壬失的抻癌基因(uP
16、por 辟 ne)的正常功能是肿痛病因性治疗的策略之 。重组腺病毒 p53 抗癌注射液已在我国批准用于头颈部肿瘤等治疗，与放疗和化疗联合应用产生协同作用。利用抑癌基因治疗肿熘在体外常能取得较好的疗效。在体内由于肿瘤俸积较大。内环境又十分复杂以及基因转移效率的限制，其确切疗效尚有待进一步观察。3 溶瘤腺病毒属肿瘤裂解性病毒(olydc vis)其特点如下：由于具有复制性，因此所需的病毒颗粒较小；能扩展至邻近胂墒细胞，作用的范围较广；溶瘤腺病毒可产生溶瘤和抗肿瘤免疫反应。但溶瘤腺病毒由_f 能够复制也就存在着不安全的因素。近年来对腺病毒生物学的研究取得突破性的进展，研究出能够选择性地在肿瘤细胞中专
17、一复制的腺病毒。 ，主耍分为两类：一类应用外源的肿榴特异性启动子控制腺病毒复制基因 Ela 表达，获得条件复制性溶瘤腺病毒(c 卧 d)。另一类利用肿瘤细胞生物学特性，如腺病毒复制时抵抗宿主细胞凋亡可能榧关的 ElB55K 蛋白发生变异或缺失时。病毒复制的宿主细胞就会发生凋亡从而复制不能完成。 ，我国批准上市的重组人 5 型臁病毒是基因组改造后的溶瘤腺病毒，其早期基因 EIB 区用 lf 编码 55kD 蛋白的一段 827 bPDN被删除，并通过基因序列的点突变，产生终止密码子而阻止 E1855kD 蛋白的表达使其选择性地在 P53 蛋白异常的肿瘤细胞中增殖，进而特异性地裂解肿瘤细胞可产生溶瘤
18、作用并激发机体抗肿瘤免疫反应。主要用于鼻咽癌等头颈部肿瘤治疗。4 自杀基因治疗一些来自病毒或细菌的基因具有一些特殊的功能，其表达产物可将原先对哺乳动物细胞无毒的或毒性极低的前药(pmd呜)转换成毒性产物，导致这癌细胞的死亡-这类基因即称为“自杀基因”(suidde gene)或“药物敏感基因” 。根据细胞白杀机制，将自杀基因作 l 为治疗性且的基因应用于肿瘤治疗的研究称为肿瘤的自杀基因疗法。由于当前对肿瘤形成的分子机制尚未完全阐明以及治疗中目的基因表达调控研究滞步不前设计肿瘤细胞特异性自杀机制的基因治疗方案对于肿瘤治疗仍具有重大的理论和宴际应用价值。(”自杀基因治疗中酶和前药：目前常用的自杀基
19、因有单纯疱疹病毒胸苷激酶(Hsvtk)基目、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VzVd)口和胞噼啶脱氨酶(cD)基因，其中尤以郴 vn 最为常用。哺乳动物细胞含有基因。只能催化脱氧胸苷磷酸化成为脱氧胸苷酸而 f 砖v 女基园产物还可催化棱苷类似物更昔洛韦(GcV)的磷酸化。这种磷酸化核苷能渗入细胞DNA干扰细胞分裂时 DNA 合成导致细脆死亡。肿瘤细胞导入 mV基因后表达 Hsv 女，从而获得对 Gcv 舯敏感性而“自杀” 正常组织不受影响。(2)自杀基目特异性控制；肿瘤自乐基因疗法的应用首先解决的问题是自杀基因在肿瘤细胞中的高效及特异表达。自杀基因必须局限于肿瘤细胞“选择性杀伤肿瘤细胞，解决这一同题
20、的方案有=种：利用免疫脂质休，受体介导法等进行定向基因转移或直接瘤内注射；利用肿瘤细胞生物学特性如肿瘤细胞和正常细胞分裂的差别，逆转录病毒介导 m 卜 Tx 基因治疗脑肿瘸选择性就是利用逆转录病毒只能转杂分裂相的肿辔细胞而神经细胞相对静止：利用肿瘤特异表达的调控序列如酪氨酸酶，甲胎蛋白(FP)和癌胚抗原(cEA)等，如在自杀基因的上游安插这些特异的转录调节序列，则可窦现自杀基因的特异性者达，从而较好地克服了传统化疗药物非选择性问题。(3)旁观者效应(by 札柚 dn e 蠡 ct)：旁观者效应指在用外源性自杀基因转染肿瘤细胞后，束被转染的肿瘤细胞可因邻近的少数肿瘤细胞携带有自杀基目而被前体药物
21、杀伤，此敢应产生与自杀基目种娄、肿瘤细胞的类型和数量有关。TKGcV 系统的旁观者效应比较明显和确定。由于日前基因转移效率不够高探讨提高旁观者效应的手段有可能为自杀基因疗法提供十新的思路，当然这有籁于旁观者效应机制的最终阐明。5 辅助性基因白疗骨髓细胞毒作用是化疗药物应用中的主要毒性反应，并限制其应用。此方面的对策之就是增强肿瘤细胞对化疔药物的敏感性和增强骨髓细胞的耐药性。利用耐药性基因 fndJuI 可设计出两种基因治疗的方法：一种是应用反义 RNA 技术以抑制异常活化的 MDR 基因，从而达到逆转肿瘤细胞化疔耐药的作用；另一方面，利用耐药性基因 mcJrl保护正常组织免受化疔药物的毒性，如
22、多药耐药性基因导人骨髓前体细胞或干细胞然后将这些细胞辅到悻内。其他化疗敏感组织如肝脏同样可以通过导 A，ndrl 基因达到保护作用。(三)其他疾病的基因治疗多基因遗传病包括 l 临床常见的高血压、糖尿病，冠心病、神经退行性疾病等对多基因遗传病的基因治疗主要是通过基因转移赋予细胞一个新的功能由于多基因遗传病涉及的基因尚不完全清楚，因此难以达到根本性的治疗目的。 ，而一些病毒感染性疾病如艾滋病的基因治疗研究已受到广泛重视，基 l 本的战略可分为三十方面：将艾滋病毒抗原基因导人靶细胞，激活机体的免疫系统提高对艾滋病毒的免疫能力；在靶细胞内表达类似物(dy)基因，目的在于降低病毒进人靶细胞的机会和降低
23、 HIv 的复制增殖；在靶细胞内表达反义核酸或者核酶，从而直接阻断 HIX，的复制增殖或破坏 HIV 基因组。第四节基因治疗问题和前景基因治疗过一垒新的医学抬疔方法问世，在短短二十余年里发展十舟迅建，但还面临着许多急需解决的问题。(1)提供更多日供利用的有治疗价值的目的基眉基目治疗是导外源性目的基因“达到治疗疾病的新型医学方法。目前，B 用于临床试验的治疗基因主要集中在少散基目。而对大部分疾病如恶性肿瘤、高血压、糖尿病，冠心辅、神经退行性疾病的致病基因还有待进-步确定。(2)设计高教的基因转穆载体一个理想的载体需要有高技基因转移率，能将外源性基因定向导入靶细胞，而目前已有的载体均属低靛。西此，
24、即使导入的基因有治疗效果，但由于不能有效地导入，效果也会大受影响。(3)解决基因治疗的靶向及表选调拉问题外源基因能否在体内被准确 有效地导入特定的细胞组织并在其中有效表达即基目在体内表达的空间、时间的精确定位和表达水平的调控。这是基因治疗应用中的关键问题，因而也成为基目治疗领域的一十研究热点。(4)基因治疗简便性；除了考虑病种特殊性外，临床应用的可能性和简便性也是重要因素。在体细胞基因治疗中。vo 掊是当前的主要选径，但在临床应用中必须把精人的靶细胞取出，在离件情况 F 进行遗传加工然后输回病人体内。(5)充分估计导人外源基因对机体的不利影响 目翦采用最多的是逆转录病毒载体它进人细胞内整合至宿主细胞染色体的部位是随机的，虽然产生插人突变几率很低，但仍有潜在的可能性。此外，外源基因产物对宿主的可能危害性。若体内出现大量原来缺乏的蛋白质，有可能引起严重免疫反应。(6)伦理学问题：人体基目治疗作为一种医疗手段存在着普追意义上的伦理学阿题。同时由于对基因结构及其变化规律的复杂性的认识还有待深化，基因治疗对基因组的改变、补充、修复，直接关系到人的健康因此作为改变人体遗传物质的非常规医疗手段卫存在着特殊的伦理学问题。(陈红专)
