1、PCR技术及其应用,生物化学实验技术,目 录,PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例,多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction),Kary B. Mullis,PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。,体内DNA的复制体系,DNA聚合酶（I II III）,拓扑异构酶解旋酶类SSB,引物dNTP Mg2+,Mullis的PCR构思,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80
2、 60 40 20,耐热DNA聚合酶,Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。,PCR反应循环,PCR的指数扩增（2n）,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,变性、退火,延伸,Taq,P1,P2,PCR反应体系,dATP,dTTP,dGTP,dCTP,Mg2+,模板：DNA引物：P1 +P2DNA聚合酶：TaqE原料：dNTP反应缓冲液10xBuffer辅助因子：Mg2+,1）PCR反应成分,（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100L。
3、模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR反应条件,（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTP（10mM or 2.5mM ） 含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/
4、L。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2）循环参数变性 使双链DNA解链为单链 94， 30-60秒(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源 序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基
5、；5端无严格限制。,Tm =（G+C）x 4 + （A+T）x 2,（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,PCR的应用 1、特定DNA片段（基因、调控序列）的鉴定、分离或制备。 A、DNA B、cDNA 2、基因表达分析（原位、离体） A、基因是否表达 B、基因表达水平高低 3、基因突变,基因克隆（）,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂交双链,PCR扩增,1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2. PCR
6、扩增细胞内目的片段3. 原位杂交检测扩增产物,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,原位分析基因表达的组织特异性,荧光定量 PCR（real-time PCR)分析基因表达水平 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。,内掺式染料SYBR Green I序列特异性探针Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特异性探针 Amplifluor (Intergen),SYBR-Green I,反向PCR (reverse PCR)
7、扩增已知序列两侧的未知序列,用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,未知序列,未知序列,已知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,实时荧光定量PCR仪,梯度PCR仪,普通PCR仪,1、材料：含0.3Kb插入片段的克隆载体2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备3、试剂：10XPCR反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1和引物2,二、实验材料、仪器和试剂,1.反应体系（50l体系）： 10 X PCR反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 1
8、0mmol/L dNTP 10mol/L 引物1 10mol/L引物2 模板DNA TaqE 补充水,三、操作步骤,2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀：,三、操作步骤,10 X Buffer 2.5 L,10 X P1 2.5 L,10X T 2.5 L,10 X E 2.5 L,25 L,水 12.5 L,10 X P2 2.5 L,3.PCR扩增程序： 94 5-10min（预变性） 94 30S 55 30S 72 30S 72 5-10min（后延伸） 4 保温,30Cycles,屏幕显示方式,Enter,循环内第一步温度和时间,不需要拓展功能,设置循环数,后延伸保温,后延伸温度和时间,预计反应时间，程序是否保存,Lid,Run,RUN PCR1Lid temperature: 19,4.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。,三、操作步骤,The End！,
