1、实验三 感受态的制备及转化一、实验目的1了解质粒 DNA 转化原理2熟悉感受态细菌的制备和转化步骤二、实验原理1感受态细胞与转化感受态指受体（或者宿主）最易接受外源 DNA 片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环 境因子的影响。cAMP 可以使感受 态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15%的无菌甘油或-70 保存（有效期 6 个月）。转化特指将质粒 DNA 或以其为载体构建的重组 DNA 导入细菌体内
2、，使之获得新的遗传特性的一种方法。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl 2 等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为 能容许外源 DNA 分子通过的感受 态细胞。进入细胞的DNA 分子通过复制、表达 实现遗传信息的转 移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl 2 法），该 法最先是由 Cohen 于1972 年发现的。其原理是细菌处于 0，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基- 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生 长数小时后，
3、球状 细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca 2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到 5106210 7转化子/ g 质粒 DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在 Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细 菌，则可使转化率提高1001000 倍。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使 DNA 进入细菌，转化率最高能达到 10910 10转化子/ug 闭环 DNA。2. 蓝白斑筛选野生型大肠杆菌产生的 -半乳糖苷酶（la
4、cZ）能将无色的化合物5-溴 -4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b- D-galactoside, X-Gal）切割成半乳糖和深蓝色化合物 5-溴-4-靛蓝，使得整个培养的菌落产生颜色的变化变为蓝色。设计使用蓝白筛选的工程菌为 -半乳糖苷酶（lacZ）缺陷的菌株，这种菌株中 -半乳糖苷 酶（lacZ ）的染色体 DNA 发生突变，造成其编码的 -半乳糖苷 酶（lacZ）失去 N 端得 146 个氨基酸的短肽（-肽）。从而不具有生物活性，即无法作用于 X-Gal 而产生蓝色物质。用于蓝白筛选的载体（如 PUC 系列）具有一个称为 lacZ，
5、的基因，该基因包括：一段编码 -半乳糖苷酶（lacZ）的启动子，编码 -肽的序列，一个多克隆区域（MCS）。MCS 位于编码 -肽的序列的区域中，是外源性 DNA 的插入位点。虽然使用蓝白筛选的工程菌因为缺失了 N 端得 146 个氨基酸而不具有生物活性，但如果该菌株含有带有 lacZ，的质粒以后，则质粒表达的 N146 个氨基酸和菌株染色体 DNA 表达的缺乏 N 端 146 个氨基酸的 -半乳糖苷酶 突变体互补，具有与完整的 -半乳糖苷酶相似的作用，能将 X-Gal 分解为蓝色物质。X-gal 蓝色化合物-半乳糖苷酶细菌感受态制备1 将 TOP10 菌体培养过夜后，以 1:100 比例接种
6、，继续培养 3 小时，于冰浴 30min，分装 EP 管中，2500rpm，4离心 5 min2 弃上清，沉淀加入 1ml 预冷 0.1mol/LCaCl2 重悬，置冰浴 15 min，2500rpm 4 离心 5 min3 弃上清，沉淀加入 0.2ml 预冷 0.1mol/LCaCl2 轻轻悬浮（此时细菌易破碎），置冰浴。转化：1 加入质粒 DNA20ul，冰浴 30min2 42 热冲击 2min 后，迅速冰浴 2min 以上3 加入 800ul Amp-LB 培养基，37 培养一个小时，250rpm/min4 取一 Amp+LB 平板，分别用 40ul X-gal（20mg/ml）、4ulIPTG(200mg/ml)均匀涂于平板上5 取 10-100ul 培养产物涂于 Amp+LB 平板6 倒置平板，于 37 培养隔夜后，观察蓝白菌斑
