1、一、引物设计 step by step 1、在 NCBI 上搜索到目的基因，找到该基因的 mRNA ，在 CDS 选项中，找到编码区所在位置， 在下面的 origin 中，Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用 Primer Premier5 搜索引物 打开 Primer Premier5，点击 File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy 目的序列在输入 框内（选择 As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击 Primer,进入引物窗口。 此窗口可以链接到“引物搜索”、“ 引物编辑” 以及“搜索结果”选项，点击 Search 按钮，进入引物
2、搜索框，选择“PCR primers” ，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在 Search Parameters 里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化， 因为 100200bp 的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300500bp. 点击 OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评 分（Rating ）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况， 包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3 不要
3、出现连续的 3 个碱基相连的 情况，比如 GGG 或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：T m 应该在 5570 度之间，GC 应该在 4555间，上游引物和下游引物的 T m 值最好不要相差太多，大概在 2 度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交 叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看 到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为 “None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错 配的话，可以就具体情
4、况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评 价需要借助于 Oligo 来完成，Oligo 自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如 Primer5. 在 Primer5 窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单 栏，选择 File-Print-Current pair，使用 PDF 虚拟打印机，即可转换为 Pdf 文档，里面有该引物的详 细信息。 3、用 Oligo 验证评估引物 在 Oligo 软件界面，File 菜单下，选择 Open ，定位到目的 cDNA 序列（在 primer 中，该序列已 经被保存为 Seq 文件
5、），会跳出来两个窗口，分别为 Internal Stability （Delta G）窗口和 Tm 窗口。 在 Tm 窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置 （Primer5 已经给出）即可，而引物长度可以通过点击 Change Current oligo length 来改变。定位 后，点击 Tm 窗口的 Upper 按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击 Lower 按钮， 确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用 Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。 Analyze 中，第一项为 Key info，点击 Selected pr
6、imers，会给出两条引物的概括性信息，其中包 括引物的 T m 值，此值 Oligo 是采用 nearest neighbor method 计算，会比 Primer5 中引物的 Tm 值略 高，此窗口中还给出引物的 Delta G 和 3端的 Delta G.3端的 Delta G 过高，会在错配位点形成双链 结构并引起 DNA 聚合反应,因此此项绝对值应该小些，最好不要超过 9。 Analyze 中第二项为 Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分 析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择 Upper/Lower ，即上下游
7、 引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响 PCR 反应异常的重要因素，因此应该避免设计的 引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其 Delta G 值应该偏低，一 般不要使其超过 4.5kcal/mol ，结合碱基对不要超过 3 个。Oligo 此项的分析窗口中分别给出了 3 端 和整个引物的二聚体图示和 Delta G 值。 Analyze 中第三项为 Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样， Delta G 值不要超过 4.5kcal/mol ，碱基对不要超过 3 个。 Analyze 中第四项为 Compositio
8、n and T m ，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比 例和 Tm 值。上下游引物的 GC需要控制在 4060，而且上下游引物之间的 GC 不要相 差太大。Tm 值共有 3 个，分别采用三种方法计算出来，包括 nearest neighbor method 、GC method 和 2(AT) 4(GC)method ，最后一种应该是 Primer5 所采用的方法，T m值可以控制在 5070 度之间。第五项为 False Priming Sites，即错误引发位点，在 Primer5 中虽然也有 False priming 分析，但不如 oligo 详细，并且 oligo 会
9、给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在 100 以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到 400500，错误引发效率超过 100 幅 度若不大的话，也可以接受。 Analyze 中，有参考价值的最后一项是“PCR” ，在此窗口中，是基于此对引物的 PCR 反应 Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引 物有不利于 PCR 反应的二级结构存在，并且 Delta G 值偏大的话，Oligo 在最后的评价中会注明， 若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。 引物评价完毕后，可以选择 FilePrint，打印
10、为 PDF 文件保存，文件中将会包括所有 Oligo 软 件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉 Tm 窗口和 Delta G 窗口， 可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和 PCR 窗口。 4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行 Blast 分析，一般来说，多少都会找到一些其他基 因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的 blast 结果进行对比分析，只要没有交叉的其 他基因的同源序列就可以。 二、引物设计过程中的心得 1、Primer 5.0 搜索引物 Primer Length 我常设置在 1830bp,短了特异性不好，长了没有
11、必要。当然有特殊要求的除外， 如加个酶切位点什么的。 PCR Product size 最好是 100500bp 之间，小于 100bp 的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带 很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 Search parameters 还是选 Manual 吧，Search stringency 应选 High，GC 含量一般是 4060。其 它参数默认就可以了。 搜索出来的引物，按 Rating 排序，逐个送 Oligo 软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产 物很短，你可以不选择它，或是引物 3 端2 个 A 或 T, 或引物内部连续的 G 或 C 太多，或引物
12、3 端2 个 G 或 C ，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标 还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好 点。 2、Oligo 6.0 评估引物 在 analyze 里，Duplex Formation 不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3-Dimer 绝对值应小于 4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall 绝对值一般应小于多少 kcal/mol 跟 PCR 退火温度有关，我几次实验感觉在 PCR 退火温度在 65的时候，The
13、most stable Dimer overall 6.7kcal/mol 没有问题。 Hairpin Formation 根据黄金法则 False priming sites: Primer 的 priming efficiency 应该是错配地方的 4 倍左右，更多当然更好。 在 PCR 栏，丁香园战友感觉其所显示的 optimal annealing temperature 数值值得参考。在 PCR 摸 索条件的时候，退火温度为其数值加减 2 的范围就可以了。 Internal stability 很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证 3 端 不要过于稳定。
14、 下图引物 3 端过于稳定，很容易导致不适当扩增。G 参照黄金法则，这其实很 好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以G 绝 对值越大结构越稳定。 3、其他 两个评价系统不一样，丁香园战友感觉 oligo 评价引物好点，primer 出来的引物，一般按效率排 序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到 oligo 测试。这是初步的选择，其实引物到了 oligo 里，退火温度也不一样。 3 端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个 50的退火温度肯定和 65对二聚体的影 响不一样了，一般来讲尽量控制在4.5kcal/mol 以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要 自己摸索）。 丁香园战友感觉 3 端有 A 无 A 影响不大，3 端有 T 是不是一定不行，不见得。软件是评估，法 则也不是没有例外，不是 112 那么确定。错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“ 到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个 都不得罪。 GC 含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3 端来两个 G 或 C, 稳定性就上去了，粘在模 板上很牢。所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。
