1、-SHANDONG 毕 业 论 文基于 ndhF 序列的植物遗传关系分析学 院 ： 生 命 科 学 学 院 专 业 ： 生 物 技 术 学 生 姓 名 ： 王维龙 学 号： 0812107614 指 导 教 师 ： 张 建 勇 20 12 年 6 月摘要-中文摘要随着分子生物学和生物信息学的快速发展, 基于各种分子数据的分析已成为植物系统学研究的主要手段, 其中以 DNA 序列的比较分析应用最为广泛。植物拥有 3 套基因组, 按进化速率由快到慢依次为核基因组( nDNA) 、叶绿体基因组( cpDNA) 和线粒体基因组(mtDNA) (Wolfe et al. , 1987) 。每套基因组内不
2、同区域的核苷酸进化速率不同, 为各分类阶元的系统学研究提供了丰富的变异来源。 ndhF 是叶绿体功能基因，该基因共含有 21 个编辑位点, 且这 21 个位点均为部分编辑。生物信息学分析及与其它物种比对结果表明, ndhF C290 位编辑可能会影响该蛋白的正确折叠。进一步使用单克隆酶切方法测定了不同胁迫处理对 ndhF C290 位编辑效率的影响。论文基于 ndhF 序列对几种植物进行了遗传关系分析。首先从 GenBank 数据库中筛选植物序列，所得序列利用软件进行相关分析，根据遗传距离及分子系统学分析对 ndhF 片段长度对比，研究并分析菊属、紫草属、狗尾草属植物的遗传关系。关键字：ndh
3、F ，分子系统学，遗传关系分析， GenBank 数据库ABSTRACT-AbstractWith the development of molecular biology and bioinformatics of rapid development, based on a variety of molecular data analysis has become the main means of plant systematics research, of which DNA comparative sequence analysis is most widely used. The p
4、lant has 3 sets of genome, according to the evolutionary rate from fast to slow in the nuclear genome, chloroplast genome ( nDNA ) ( cpDNA ) and mitochondrial genome ( mtDNA ) ( Wolfe et al.,1987). Each genome within different regions of nucleotide evolution rate, for each taxon of the system scienc
5、e research provides a rich source of variation.ndhF is a function of chloroplast gene, the gene contains 21 edit sites, and these 21loci are part of editing. Bioinformatics analysis and other species than the results show that, ndhF C290editors may influence the protein is correctly folded. Further
6、use of monoclonal enzyme digestion method for the determination of the different stress treatments on ndhF C290editing efficiencyBased on the ndhF sequence of several plant performed a genetic relationship analysis. First, from the GenBank database screening plant sequences, the sequence using the s
7、oftware according to the correlation analysis, genetic distance and molecular phylogenetic analysis of ndhF fragment length comparison, research and analysis of genetic relationship of orchidsKey words: ndhF genetic, molecular systematics , GenBank database, relationship analysis目 录- III -目 录中文摘要 .I
8、ABSTRACT.II目 录 .III第一章 引 言 .- 1 -1.1 课题背景和意义 .- 1 -1.2 GenBank 数据库和 NCBI.- 1 -1.3 菊属、紫草属、狗尾草植物 .- 3 -1.3.1 菊属、紫草属、狗尾草属植物的概况 .- 3 -1.3.2 菊属、紫草属、狗尾草属植物的观赏价值 .- 5 -1.3.3 菊属、紫草属、狗尾草属植物的药用价值及其有效成分 .- 5 -1.4 DNA 序列分析在植物分子系统学研究中的应用和难题 .- 7 -1.4.1 分子系统学 .- 7 -1.4.2 DNA 序列分析在植物分子系统学研究中的应用 .- 8 -1.4.3 DNA 序列在
9、植物分子系统学研究中的发展 .- 8 -1.4.3.1 由 DNA 单一序列分析向多序列分析发展 .- 8 -1.4.3.2 由常用 DNA 片段分析向低拷贝核基因分析发展 .- 9 -1.4.4 在植物分子系统学研究中常见的难题 .- 9 -1.4.4.1 系统分析结果存在冲突 .- 9 -1.4.4.2 系统关系无法得到解决 .- 10 -1.4.5 DNA 条形码 .- 11 -第二章 实验方法 .- 14 -2.1 材料与方法 .- 14 -2.1.1 主要软件 .- 14 -2.1.2 数据来源 .- 14 -2.1.3 材料 .- 14 -2.1.4 数据分析 .- 17 -第三章
10、 结果与讨论 .- 18 -目 录- IV -3.1 结果分析 .- 18 -3.1.1 ndhF 序列长度和 C+G 百分含量 .- 18 -3.1.2 遗传距离分析 .- 18 -3.1.3 聚类分析 .- 20 -3.2 讨论 .- 20 -3.2.1 ndhF 作为候选 DNA 条形码的优势 .- 20 -3.2.2 通过 GenBank 查寻 DNA 条形码研究植物遗传关系的可行性 .- 23 -结 论 .- 23 -参考文献 .- 24 -致 谢 .- 26 -第一章 引 言- 1 -第一章 引 言1.1 课题背景和意义菊科是菊 糖 完 全 代 替 了 淀 粉 作 为 多 聚 糖
11、贮 存 。 菊 科 所 含 有 的 倍 半 萜 内 酯类 具 有 强 心 、 抗 癌 、 驱 虫 、 镇 痛 等 作 用 。 禾 本 科 是 种 子 植 物 中 最 有 经 济 价 值的 大 科 。 是 人 类 粮 食 和 牲 畜 饲 料 的 主 要 来 源 ， 也 是 加 工 淀 粉 、 制 糖 、 酿 酒 、造 纸 、 编 织 和 建 筑 方 面 的 重 要 原 料 。 紫 草 科 有 著 名 药 用 植 物 紫 草 、 早 春 野 花斑 种 草 、 附 地 菜 等 ， 并 且 有 与 紫 草 具 有 同 样 药 效 的 软 紫 草 、 滇 紫 草 等 ； 有 饲料 植 物 聚 合 草 ；
12、 有 观 赏 植 物 基 及 树 （ 福 建 茶 ） 、 牛 舌 草 ； 有 油 料 植 物 破 布 木 。随着生物技术的发展，鉴别技术已从植物形态鉴别的器官水平，向以显微粉末为基础从维管束、薄壁细胞、石细胞等形态和结构来鉴别的细胞水平发展，并正向以DNA鉴别和多态性分析、化学成分鉴别等为特征的分子水平深入。隐存种的发现、识别及形成机制是分类学研究的一个难点。虽然同工酶、RFLP、RAPD 、核基因以及叶绿体DNA片段等分子手段被相继用于研究苔藓植物的隐存种形成机制, 但是目前已报道的相关种类不过是冰山一角。近年, DNA条形码技术受到了各国科学家的高度重视, 已应用于分类学、分子系统学、种群
13、遗传学的研究。1.2 GenBank 数据库和 NCBIGenBank 是一个有来自于70,000多种生物的核苷酸序列的数据库。每条纪录都有编码区（CDS）特征的注释，还包括氨基酸的翻译。GenBank属于一个序列数据库的国际合作组织，包括EMBL和DDBJ。GenBank数据库中的序列信息量大 , 来源物种丰富、涵盖广泛, 尽管尚有一定不足, 但仍可用于筛选植物候选DNA条形码。根据GenBank中150条叶绿体ndhF基因的序列 , 采用BLAST 相似性分析, 评价了这两个 DNA片段作为植物DNA条形码的可行性。第一章 引 言- 2 -NCBI(美国国立生物技术信息中心)理解自然无声但
14、精妙的关于生命细胞的语言是现代分子生物学的要求。通过只有四个字母来代表DNA化学亚基的字母表，出现了生命过程的语法，其最复杂形式就是人类。阐明和使用这些字母来组成新的“单词和短语 ”是分子生物学领域的中心焦点。数目巨大的分子数据和这些数据的隐秘而精细的模式使得计算机化的数据库和分析方法成为绝对的必须。挑战在于发现新的手段去处理这些数据的容量和复杂性，并且为研究人员提供更好的便利来获得分析和计算的工具，以便推动对我们遗传之物和其在健康和疾病中角色的理解。它的使命包括四项任务：1.建立关于分子生物学，生物化学，和遗传学知识的存储和分析的自动系统2. 实行关于用于分析生物学重要分子和复合物的结构和功
15、能的基于计算机的信息处理的，先进方法的研究3.加速生物技术研究者和医药治疗人员对数据库和软件的使用。NCBI通过下面的计划来实现它的四项目的：NCBI有一个多学科的研究小组包括计算机科学家，分子生物学家，数学家，生物化学家，实验物理学家，和结构生物学家，集中于计算分子生物学的基本的和应用的研究。这些研究者不仅仅在基础科学上做出重要贡献，而且往往成为应用研究活动产生新方法的源泉。他们一起用数学和计算的方法研究在分子水平上的基本的生物医学问题。这些问题包括基因的组织，序列的分析，和结构的预测。目前研究计划的一些代表是：检测和分析基因组织，重复序列形式，蛋白domain和结构单元，建立人类基因组的基
16、因图谱，HIV感染的动力学数学模型，数据库搜索中的序列错误影响的分析，开发新的数据库搜索和多重序列对齐算法，建立非冗余序列数据库，序列相似性的统计显著性评估的数学模型和文本检索的矢量模型。另外，NCBI研究者还坚持推动与NIH内部其他研究所及许多科学院和政府的研究实验室的合作。第一章 引 言- 3 -1.3 菊属、紫草属、狗尾草植物1.3.1 菊属、紫草属、狗尾草属植物的概况菊属是菊科(Asteraceae) 的一属。约 100种，多可供观赏，主要原产旧大陆亚热带及温带地区。栽培种的头状花序较野生种大得多。该属多数植物叶芳香，互生。头状花序上盘花和边花同时存在或缺边花。如野黄菊全国均有分 布，
17、紫野菊分布在华东、华北及东北地区，毛华菊分布在华中，甘菊多分布于东北及华北， 小红菊多分布于华北及东北，菊花脑产于南京。菊花品种遍布全国各城镇与农村，尤以北京、 南京、上海、杭州、青岛、天津、开封、武汉、成都、长沙、湘潭、西安、沈阳、广州、中山市小 榄镇等为盛。 8世纪前后，作为观赏的菊花由我国传至日本，被推崇为日本国微的图样。为多年生草植物。喜凉爽、较耐寒，生长适温1821，地下根茎耐旱，最忌积涝，喜地势高、土层深厚、富含腐殖质、疏松肥沃、排水良好的壤土。在微酸性至微碱性土壤中皆能生长。而以Ph6.2-6.7 最好。为短日照植物，在每天14.5小时的长日照下进行营养生长，每天12小时以上的黑
18、暗与10的夜温适于花芽发育。紫草属是紫草科的一属，约60种，分布于温带地区，我国有4种，产西南至西北、东北，其中紫草L. erythrorhizon Sieb. et Zucc. 的根供染料用。一年生或多年生草本或亚灌木；叶互生，全缘；花白色、黄色或青紫色，组成穗状花序或总状花序；萼通常分裂，裂片5，线形；花冠管状或高脚碟状，裂片5，覆瓦状排列，喉部有时有附属体或有毛；雄蕊5。内藏，花丝短，花药长圆形，药隔有时伸出成一短尖头；子房4裂，胚珠4颗；小坚果4，平滑或有小疣体。狗尾草属是禾本科，约140种，分布温带和热带地区，我国约17种，分布甚广，其中最常见的有狗尾草S. viridis （L.
19、）Beauv. ，金色狗尾草S.glauca（L. ）Beauv. 和粽叶狗尾草S. palmifolia（Willd. ）Stapf等，茎叶可作饲料；粟（小米）S. italica（L. ） Beauv. 为我国很早就栽培的一种粮食作物，有很多品种和品系。一年生或多年生草本；圆锥花序顶生，圆柱状或疏展呈塔状，小穗第一章 引 言- 4 -无芒，有12小花，全部或部分小穗托以1至数枚刚毛，脱落于极短而呈杯状的小穗柄上，刚毛宿存，第一颖卵形或圆形，比小穗短1/4 至1/2 ，第二颖约与小穗等长，第一小花雄性或中性，外稃与第二颖同质，第二小花两性，外稃革质，平滑或有皱纹。种子发芽适宜温度为1530。
20、种子出土适宜深度为25cm,土壤深层未发芽的种子可存活10年以上。中国北方45月出苗,以后随浇水或降雨还会出现出苗高峰;69月为花果期。一株可结数千至上万粒种子。种子借风、灌溉浇水及收获物进行传播。种子经越冬休眠后萌发。适生性强,耐旱耐贫瘠,酸性或碱性土壤均可生长。生于农田、路边、荒地。狗尾草，一年生草本。秆直立或基部膝曲，高10-100cm，基部径达3-7mm。叶鞘松弛，边缘具较径的密绵毛状纤毛；叶舌极短，边缘有纤毛；叶片扁平，长三角状狭披针形或线状披针形，先端长渐尖，基部钝圆形，几成栽状或渐窄，长4-30cm，宽2-18mm，通常无毛或疏具疣毛，边缘粗糙。圆锥花序紧密呈圆柱状或基部稍疏离，
21、直方或稍弯垂，主轴被较长柔毛，长2-15cm，宽4-13mm（除刚毛外） ，刚毛长4-12mm，粗糙，直或稍扭曲，通常绿色或褐黄到紫红或紫色；小穗2-5个簇生于主轴上或更多的小穗着生在短小枝上，椭圆形，先端钝，长2-2.5mm，铅绿色；第1颖卵形，长约为小穗的1/3，具3脉，第2颖几与小穗等长，椭圆形，具5-7脉；第1外稃与小穗等长，具5-7脉，先端钝，其内稃短小狭窄，第2外稃椭圆形，具细点状皱纹，边缘内卷，狭窄；鳞被楔形，先端微凹；花柱基分离。颖果灰白色。花、果期5-10月。 叶鞘较松弛，无毛或具柔毛；叶舌具长12毫米的纤毛；叶片扁平，长530厘米，宽215毫米，顶端渐尖，基部略呈圆形或渐窄
22、，通常无毛。圆锥花序紧密呈圆柱形，长215厘米，微弯垂或直立，绿色、黄色或变紫色；小穗椭圆形，先端钝，长22.5毫米；第一颖卵形，具3脉，第二颖具5脉；第一外稃与小穗等长，具57脉，有一窄狭的内稃。谷粒长圆形，顶端钝，具细点状皱纹。花果期夏秋间。第一章 引 言- 5 -1.3.2 菊属、紫草属、狗尾草属植物的观赏价值菊花是我国名花之一,历时历代受到人们的喜爱。我国栽培菊花的历史悠远,长久以来人们在赏菊时形成了一定的品评标准,一盆合格的独本菊应具备:每盆一本,着花一朵,花大瓣重,色泽艳丽,叶色墨绿,叶片肥大不脱节,茎干粗直,节间短密均匀,无病虫害,高度约45cm,能充分体现本品种的特点。狗尾草初
23、生时是小小的细细的一到两片的嫩叶，远望去几乎不见。然而只需要一场微雨，便足以让它蓬勃成燎原之势。虽然根须浅浅地几乎只是浮在土上，然而若是拔得不彻底或是拔完了仍然扔在地里，那么依旧是不能置它于死地的，只需要一夜的露水，便足以让它生出新芽或者复活，其生命力之强，常让人惊叹不已。待到稍长大一些，便拔节生出一根细长的穗来，结满了千百颗籽粒，毛茸茸的摇曳在风里，仿佛调皮的小狗在抖动着尾巴。1.3.3 菊属、紫草属、狗尾草属植物的药用价值及其有效成分菊花除有较高的观赏价值外，还有很多实用价值。可以食用、茶用、药用。御香缥缈录中记载：慈禧爱吃白菊花。广东人以菊花为酒宴名贵配料。南京人以菊叶做菜入汤。据说，河
24、南开封人用菊花包饺子，其滋味清香爽口，引人食欲。现已生产的菊花食品有菊花晶、菊花糕、菊花酒等。 菊花为菊科多年生草本植物，是我国传统的常用中药材之一，主要以头状花序供药用。据古籍记载，菊花味甘苦，性微寒;有散风清热、清肝明目和解毒消炎等作用。对口干、火旺、目涩，或由风、寒、湿引起的肢体疼痛、麻木的疾病均有一定的疗效。主治感冒风热，头痛病等。对眩晕、头痛、耳鸣有防治作用。菊花有野菊和家菊之分，其中家菊清肝明目，野菊祛毒散火，甘苦微寒,清热解毒,对眼睛劳损、头痛、高血压等均有一定效用。 本草纲目中对菊花茶的药效也有详细的记载：性甘、微寒，具有散风热、平肝明目之功效。 神农本草经认为，白菊花茶能“主诸风头眩、肿痛、目欲脱、皮肤死肌、恶风湿痹，久服利气，轻身耐劳延年。 ”现代医学也研究证实，菊花具有降血压、消除癌细胞、扩张冠状动脉和抑
