干旱胁迫对植物生理生化指标的影响.docx

1、1干旱胁迫对植物生理生化指标的影响摘要：水是生命之源，地球上任何生物的生存都离不开水。并且，很多生物在出现缺水时都表现出一系列相应的症状，特别是植物最明显。植物常常遭受的有害影响因素之一就是缺水，当植物消耗的水分无法从外界得到补充时，就会使植物体内的一些生理生化指标发生变化，如脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H 2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)等的含量。实验通过分光光度计分别在不同的波长中测出吸光率，间接计算出其含量，我们通过测定这些指标含量的变化就可以知道干旱对植物的损伤有多严重。植物经常遭受干旱胁迫的危害，全世界干旱、半干旱地区的面积占

2、总面积的 43%，而中国更为严重，约占 51.9%，因而研究植物的抗旱性尤为重要。由实验数据可知，当小麦受到干旱胁迫时，小麦幼苗的脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H 2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)的含量均升高。关键词：干旱、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H 2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)1. 引言1.1 干旱及干旱对植物的影响干旱化已成为世界性的问题，中国干旱半干旱地区面积为2566104km2，占国土面积的 26.73。在我国各干旱省份中，云南又属于干旱的省份之一。对植物影响的诸

3、多自然因素中，干旱占首位。因此研究干旱对植物的影响就尤为重要，以利于应用于农作物上。在农业上可以采取植物的各种抗旱机制来抵抗干旱对农作物的损伤，才不致使庄稼减产，利于丰收。那么，究竟什么算干旱呢？就让我们来看看它的定义吧！2当植物耗水大于吸水时，就会使组织内水分亏损，简而言之，过度水分亏缺的现象，称为干旱。干旱可分为大气干旱和土壤干旱。土壤干旱时，植物生长困难或完全停止，受害情况比大气严重 。我国农业每年受旱灾面积达 2500多万 km2。 1 水分在植物的生命活动中起着极大的作用,全世界由于水分亏缺导致的减产超过其他因素造成的减产的总和 2。大多数植物遭受干旱逆境后各个生理过程都会受到不同程

4、度的影响。随着干旱时间的延长，植物可吸收的水分越来越少。因此，植物的一些生理生化指标都发生了一定程度的变化。1.2 实验的目的及意义希望可以通过本次实验让我们掌握干旱胁迫下植物的一些生理生化指标的测定方法，并且通过测定这些指标含量的变化来了解干旱对植物的伤害有多严重，及干旱胁迫对植物的伤害原因及研究其抗旱机理。当知道植物的抗旱机制后我们就可以利用其抗旱机制，采取相应的措施来保护植物了，特别是一些农作物和一些景观植物。2. 材料与方法2.1 材料植物材料：小麦种子、玉米种子；主要试剂：0.1% HgCl2 ，TTC，3%磺基水杨酸（SSA） ，冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8) ，0.6%T

5、BA（用 0.6% TCA 配制） ， PBS (pH=6.8，内含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2 用 20%(v/v) H2SO4 配制 ，PBS,（pH=5.8,内含 0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） ， POD 反应混合液（10 mmol/L 愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用 PBS 溶解） ，PPO 反应混合液（ 20 mmol/L3邻苯二酚，用 PBS 溶解）5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7) ，4 mM DTNB (用 0.1M pH=6.8PBS 现配)。主要仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。2.2 实验种子的处理：品种为晴 3 或

6、鲁玉 13 的玉米种子或小麦种子（购于西山种子公司） 用 0.1% HgCl2消毒 10 min 后 用蒸馏水漂洗干净 用蒸馏水于 26下吸涨 12 h 播于垫有 6 层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm16cm）中 于26下暗萌发 60 h 计算发芽率（注意与前面结果比较） 选取长势一致的玉米幼苗做干旱 5 天、高温、盐渍或低温下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗） 。种子发芽率的测定： 各取 50 粒吸胀的玉米种子或小麦种子沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒） ，进行下列实验： 其中 50 个半粒进行 TTC 染色（30水浴 20 min） ，取 50 个半粒进行曙红染色（室温染色 10 mi

7、n）洗净后观察。根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。2.3 实验方法及步骤（1） 、脯氨酸(Pro)含量的测定Pro 的提取：分别取 0.1 g 实验组和对照组的幼苗加入 3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂充分研磨用 2 mL 3% SSA 洗研钵5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积。4测 定：上清液各 2 mL 分别加入 2 mL 冰乙酸和 2 mL 茚三酮试剂煮沸15 min冷却后5000 rpm 离心 10 min（若没沉淀可略此步骤） 分别测定 A520计 算：（2） 、丙二醛(MDA)含量的测定MDA 提取：分别取 0.1 g 实验组和对照组加入 3 m

8、L 10% TCA 和少许石英砂充分研磨用 2 mL 10%TCA 洗研钵5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积。测 定：分别取上清液各 2 mL 加入 0.5%TBA（用 10%TCA 配制） 2 mL煮沸 15 min冷却后5000 rpm 离心 5 min （视沉淀有无）分别测定 OD450和 OD532。计 算：OD450 = C185.4OD532 = C17.4155000C 2解得：C1（mmolL）=11.71 OD 450C2（mmolL）= 6.45 OD 532 - 0.56 OD450(式中，C 1为可溶性糖浓度，C 2为 MDA 的浓度。)（3）过氧化氢(

9、H 2O2)含量的测定5H2O2提取：分别取 0.1 g 实验组和对照组加入 3 mL 0.3%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用 2 mL TCA 洗研钵5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积。测 定：分别取上清液各 4 mL 加入 0.1%Ti(SO4)2 用 20%(v/v) H2SO4配制0.2 mL摇匀 OD 410计 算：（4） 、抗氧化酶含量的测定抗氧化酶的提取：分别取 0.1 g 实验材料加入少许石英砂和 3 ml 提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,内含 0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） 充分研磨 转入离心管中用 2 ml 提取液洗研钵

10、 5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积用于测定 POD 和PPO 酶活性或分装后转至-20 或-80保存。 （5） 、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)含量的测定POD 测定：取 POD 反应混合液（10 mmol/L 愈创木酚，5 mmol/L H 2O2,用 PBS溶解）3 ml，加入酶液 50l（空白调零用提取液取代） ，立即记时，摇匀，读出反应 0.5 和 1.5 min 时的 A470。PPO 测定：取 PPO 反应混合液（ 20 mmol/L 邻苯二酚，用 PBS 溶解）3 ml，加入酶液 0.1 ml（空白调零用提取液取代） ，立即记时，摇匀，读出反应 0.

11、5 和 1.5 min 时的 A410。以每分钟 A 值变化 0.01 所需要的酶液的量为一个活力单位（U） ，则：6（6） 、谷胱甘肽(GSH)含量的测定GSH 的提取：分别取 0.1 g 实验组和对照组的幼苗加入 3 mL 3%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用 2 mL 3% TCA 洗研钵 5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积。测 定：上清液各 2 mL (空白用 3%三氯乙酸代替) 分别加入 0.4 mL1M NaOH 1 mL 2 mM DTNB 25 5 min测定 A412计 算：3. 实验结果及分析：（1）发芽率的测定： 小麦：TTC 染色法：48 个具有

12、活力，因此其发芽率为：48/50100%=96%；曙红染色法：50 个具有活力，因此其发芽率为：50/50100%=100%。玉米：TTC 染色法：45 个具有活力，因此其发芽率为：45/50100%=90%；曙红染色法：47 个具有活力，因此其发芽率为：47/50100%=94%。分析：两种方法测定的发芽率不一样，可能是因为：由数据可以看出，TTC 染色的种子发芽率普遍比曙红染色的低，可能是因为 TTC 染色法的染色部位是胚，7曙红染色法的染色部位是胚乳，并且在种子中胚比胚乳小很多，有的种子被虫吃了一部分，或者是切种子的时候另一半没有切到胚，影响观察结果，所以TTC 染色的发芽率比曙红染色的

13、低。（2）脯氨酸（Pro）含量测定： A520 V 总 V 显 V 用 Pro content 干旱组 1.296 4.6ml 6ml 2ml 55.20 mol.g-1FW对照组 0.047 4.9ml 6ml 2ml 2.13 mol.g-1FW计算过程：根据公式：（式中 =3.24 mol.cm，L=1cm,W=0.1g）带入数据可求得 Pro content。计算结果为干旱组脯氨酸含量为 55.2 mol.g-1FW，对照组脯氨酸含量为 2.13 mol.g-1FW.实验组与对照组比较，可以看出实验组的脯氨酸含量是对照组的825.9 倍左右，表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中 Pro 含量迅

14、速上升。（3）丙二醛（MDA）含量的测定：OD532 OD450 C1 C2干旱组 0.347 0.954 11.170 mmol/L 1.704 mmol/L 对照组 0.043 0.051 0.597 mmol/L 0.249mmol/L 计算过程：根据公式：OD450 = C185.4OD532 = C17.4155000C 2解得：C1（mmolL）=11.71 OD 450C2（mmolL）= 6.45 OD 532 - 0.56 OD450(式中，C 1为可溶性糖浓度，C 2为 MDA 的浓度。)可计算出 C1， C 2的值。9计算结果为干旱组的 MDA 的浓度为 1.704 mm

15、ol/L，对照组的 MDA 的浓度为0.249mmol/L，干旱组为对照组的 6.8 倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中 MDA 含量比正常生长的含量高。（4）H 2O2测定：V 总 V 用 V 显 OD 410 H2O2 content 干旱组 4.8 ml 4 ml 4.2 ml 0.638 9.924 mol.g-1FW对照组 4.7 ml 4 ml 4.2 ml 0.476 2.305 mol.g-1FW计算过程：根据公式：（式中 =3.24 mol.cm，L=1cm,W=0.1g）带入表中的数据即可算出 H2O2 content。计算结果得到干旱组中 H2O2为 9.924 um

16、ol.g-1FW，对照组中 H2O2为 2.305 10umol.g-1FW，干旱组为对照组的 4.3 倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中 H2O2含量上升。（5）POD 的测定: V 总 V 显 V 用干旱组 5.5ml 3.05ml 3ml对照组 5.2ml 3.05ml 3mlPOD 在不同时间的 A470值： 0.5 min 1.5 min POD activities（t=0.5min）POD activities(t=1.5min)干旱组 0.112 0.253 3.87umol.g-1FWmin-1 2.91umol.g-1FWmin-1对照组 0.097 0.228 3.17umol.g-1FWmin-1 2.48umol.g-1FWmin-1计算过程：根据公式：（式中 =3.24 mol.cm，W=0.1g）可计算分别出 POD activities。