1、1. 建树前的准备工作 1.1 相似序列的获得BLAST BLAST 是目前常用的数据库搜索程序，它是 Basic Local Alignment Search Tool 的缩写，意为“基本局部相似性比对搜索工具”(Altschul et al.,199062;199763)。国际著名生物信息中心都提供基于 Web 的 BLAST 服务器。BLAST 算法的基本思路是首先找出检测序列和目标序列之间相似性程度最高的片段，并作为内核向两端延伸，以找出尽可能长的相似序列片段。 首先登录到提供 BLAST 服务的常用网站，比如国内的 CBI、美国的 NCBI、欧洲的 EBI 和日本的 DDBJ。这些网
2、站提供的 BLAST 服务在界面上差不多，但所用的程序有所差异。它们都有一个大的文本框，用于粘贴需要搜索的序列。把序列以 FASTA 格式(即第一行为说明行，以“”符号开始，后面是序列的名称、说明等，其中“”是必需的，名称及说明等可以是任意形式，换行之后是序列)粘贴到那个大的文本框，选择合适的 BLAST 程序和数据库，就可以开始搜索了。如果是 DNA 序列，一般选择 BLASTN 搜索 DNA 数据库。 这里以 NCBI 为例。登录 NCBI 主页- 点击 BLAST-点击 Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)-在 Search 文本框中粘贴检测序列-点击
3、 BLAST!-点击 Format-得到 result of BLAST。 BLASTN 结果如何分析(参数意义 )： gi|28171832|gb|AY155203.1| Nocardia sp. ATCC 49872 16S ribosomal RNA gene, complete sequence Score = 2020 bits (1019), Expect = 0.0 Identities = 1382/1497 (92%), Gaps = 8/1497 (0%) Strand = Plus / Plus Query: 1 gacgaacgctggcggcgtgcttaacacat
4、gcaagtcgagcggaaaggccctttcgggggt 60 | | | Sbjct: 1 gacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagcggtaaggcccttc-ggggt 58 Query: 61 actcgagcggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctgccttcagctctgggataagc 120 | | | | | Sbjct: 59 acacgagcggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgcctcgtactctgggataagc 118 Score ：指的是提交的序列和搜索出的序列之间的分值
5、，越高说明越相似； Expect：比对的期望值。比对越好， expect 越小,一般在核酸层次的比对，expect 小于 1e-10，就比对很好了，多数情况下为 0； Identities：提交的序列和参比序列的相似性，如上所指为 1497 个核苷酸中二者有 1382 个相同； Gaps：一般翻译成空位，指的是对不上的碱基数目； Strand：链的方向，Plus / Minus 意味着提交的序列和参比序列是反向互补的，如果是 Plus / Plus 则二者皆为正向。 1.2 序列格式：FASTA 格式 由于 EMBL 和 GenBank 数据格式较为复杂，所以为了分析方便也出现了十分简单的FA
6、STA 数据格式。FASTA 格式又称为 Pearson 格式，该种序列格式要求序列的标题行以大于号“”开头，下一行起为具体的序列。一般建议每行的字符数不超过 60 或 80 个，以方便程序处理。多条核酸和蛋白质序列格式即将该格式连续列出即可，如下所示： E.coli 1 aaattgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa 61 gtcgaacggt aacaggaaga agcttgcttc tttgctgacg agtggcggac AY631071 Jiangella gansuensis YIM 002 1
7、 gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc ggaaaggccc tttcgggggt 61 actcgagcgg cgaacgggtg agtaacacgt gggtaacctg ccttcagctc tgggataagc 其中的为 Clustal X 默认的序列输入格式，必不可少。其后可以是种属名称，也可以是序列在 Genbank 中的登录号 (Accession No.)，自编号也可以，不过需要注意名字不能太长，一般由英文字母和数字组成，开首几个字母最好不要相同，因为有时 Clustal X 程序只默认前几位为该序列名称。回车换行后是序列。将
8、检测序列和搜索到的同源序列以 FASTA格式编辑成为一个文本文件(例：C:tempjc.txt) ，即可导入 Clustal X 等程序进行比对建树。 2. 构建系统树的相关软件和操作步骤 构建进化树的主要步骤是比对，建立取代模型，建立进化树以及进化树评估。鉴于以上对于构建系统树的评价，结合本实验室实际情况，以下主要介绍 N-J Tree 构建的相关软件和操作步骤。 2.1 用 Clustal X 构建 N-J 系统树的过程 (1) 打开 Clustal X 程序，载入源文件. File-Load sequences- C:tempjc.txt. (2) 序列比对 Alignment - Ou
9、tput format options - Clustal format； CLUSTALW sequence numbers: ON Alignment - Do complete alignment (Output Guide Tree file, C:tempjc.dnd；Output Alignment file, C:tempjc.aln；) Align waiting 等待时间与序列长度、数量以及计算机配置有关。 (3) 掐头去尾 File-Save Sequence as Format: CLUSTAL GDE output case: Lower CLUSTALW sequen
10、ce numbers: ON Save from residue: 39 to 1504 (以前后最短序列为准) Save sequence as: C:tempjc-a.aln OK 将开始和末尾处长短不同的序列剪切整齐。这里，因为测序引物不尽相同，所以比对后序列参差不齐。一般来说，要“掐头去尾” ，以避免因序列前后参差不齐而增加序列间的差异。剪切后的文件存为 ALN 格式。 (4) File-Load sequences-Replace existing sequences?-Yes- C:tempjc-a.aln 重新载入剪切后的序列。 (5) Trees-Output Format O
11、ptions Output Files : CLUSTAL format tree Phylip format tree Phylip distance matrix Bootstrap labels on: NODE CLOSE Trees-Exclude positions with gaps Trees-Bootstrap N-J Tree ： Random number generator seed(1-1000) : 111 Number of bootstrap trails(1-1000): 1000 SAVE CLUSTAL TREE AS: C:tempjc-a.njb SA
12、VE PHYLIP TREE AS: C:tempjc-a.njbphb OK waiting 等待时间与序列长度、数量以及计算机配置有关。在此过程中，生成进化树文件*.njbphb，可以用 TreeView 打开查看。 (6) Trees-Draw N-J Trees SAVE CLUSTAL TREE AS: C:tempjc-a.nj SAVE PHYLIP TREE AS: C:tempjc-a.njph SAVE DISTANCE MATRIX AS: C:tempjc-a.njphdst OK 此过程中生成的报告文件*.nj 比较有用，里面列出了比对序列两两之间的相似度，以及转换和
13、颠换分别各占多少。 (7) TreeView File-Open-C:tempjc-a.njbphb Tree- phylogram(unrooted, slanted cladogram，Rectangular cladogram 多种树型) Tree- Show internal edge labels (Bootstrap value)(显示数值) Tree- Define outgroup ingroup outgroup OK(定义外群) Tree- Root with outgroup 通常需要对进化树进行编辑，这时首先要 Edit-Copy 至 PowerPoint 上，然后 C
14、opy 至 Word上，再进行图片编辑。如果直接 Copy 至 Word 则显示乱码，而进化树不能正确显示。 2.2 Mega 建树 虽然 Clustal X 可以构建系统树，但是结果比较粗放，现在一般很少用它构树，Mega 因为操作简单，结果美观，很多研究者选择用它来建树。 (1) 首先用 Clustal X 进行序列比对，剪切后生成 C:tempjc-a.aln 文件；( 同上) (2) 打开 BioEdit 程序，将目标文件格式转化为 FASTA 格式， File-Open- C:tempjc-a.aln， File-Save As- C:temp jc-b.fas； (3) 打开 Me
15、ga 程序，转化为 mega 格式并激活目标文件， File-Convert To MEGA Format- C:temp jc-b.fas C:temp jc-b.meg， 关闭 Text Editor 窗口-(Do you want to save your changes before closing?-Yes)； Click me to activate a data file- C:tempjc-b.meg-OK- (Protein-coding nucleotide sequence data?-No)； Phylogeny-Neighbor-Joining(NJ) Distanc
16、e Options-Models-Nucleotide: Kimura 2-parameter; d: Transitions+Transversions; Include Sites-Pairwise Deletion Test of Phylogeny-Bootstrap; Replications 1000; Random Seed 64238 OK；开始计算得到结果； (4) Image-Copy to Clipboard-粘贴至 Word 文档进行编辑。 此外，Subtree 中提供了多个命令可以对生成的进化树进行编辑，Mega 窗口左侧提供了很多快捷键方便使用；View 中则给出了
17、多个树型的模式。下面只介绍几种最常用的： Subtree-Swap:任意相邻两个分支互换位置； -Flip:所选分支翻转 180 度； -Compress/Expand:合并/展开多个分支； -Root:定义外群； View-Topology：只显示树的拓扑结构； -Tree/Branch Style:多种树型转换； -Options:关于树的诸多方面的改动。 2.3 TREECON 打开 Clustal X，File-Load sequences-jc-a.aln，File-Save Sequence as(Format-PHYLIP；Save from residue-1 to 末尾；Sa
18、ve sequence as : C:tempjc.phy)； 打开 TREECON 程序， (1) Distance estimation 点击 Distance estimation-Start distance estimation，打开上面保存的 jc.phy 文件，Sequence Type-Nuleic Acid Sequence，Sequence format-PHYLIP interleaved，Select ALL，OK； Distance Estimation-Jukes&Cantor(or Kimura)，Alignment positions-All，Bootstrap
19、 analysis-Yes，Insertions&Deletions-Not taken into account，OK； Bootstrap samples-1000，OK；运算，等待 Finished-OK。 (2) Infer tree topology 点击 Infer tree topology-Start inferring tree topology，Method-Neighbor-joining, Bootstrap analysis-Yes，OK.；运算，等待Finished-OK。 (3) Root unrooted trees 点击 Root unrooted trees
20、-Start rooting unrooted trees，Outgroup opition-single sequence(forced)，Bootstrap analysis-Yes，OK； Select Root-X89947，OK；运算，等待 Finished-OK。 (4) Draw phylogenetic tree 点击 Draw phylogenetic tree，File-Open-(new) tree，Show-Bootstrap values/ Distance scale。 File-Copy，粘贴至 Word 文档，编辑。 TREECON 的操作过程看起来似乎较 ME
21、GA 烦琐，且运算速度明显不及 MEGA，如果参数选择一样，用它构建出来的系统树几乎和 MEGA 构建的完全一样，只在细节上，比如Bootstrap 值二者在某些分支稍有不同。在参数选择方面，TREECON 和 MEGA 也有些不同，但总体上相差不大。 2.4 PHYLIP PHYLIP 是多个软件的压缩包，下载后双击则自动解压。当你解压后就会发现 PHYLIP 的功能极其强大，主要包括五个方面的功能软件：i，DNA 和蛋白质序列数据的分析软件。ii，序列数据转变成距离数据后，对距离数据分析的软件。 iii，对基因频率和连续的元素分析的软件。iv，把序列的每个碱基 /氨基酸独立看待（碱基 /氨
22、基酸只有 0 和 1 的状态）时，对序列进行分析的软件。v，按照 DOLLO 简约性算法对序列进行分析的软件。vi ，绘制和修改进化树的软件。在此，主要对 DNA 序列分析和构建系统树的功能软件进行说明。 (1) 生成 PHY 格式文件 首先用 Clustal X 等软件打开剪切后的序列文件 C:tempjc-a.aln 另存为 C:tempjc.phy(使用File-Save Sequences As 命令，Format 项选“PHY”)。用 BioEdit 或记事本打开(2) 打开Phylip 软件包里的 SEQBOOT seqboot.exe: cant find input file
23、“infile“ Please enter a new file name C:tempjc.phy 按路径输入刚才生成的 *.PHY 文件，显示如下： Bootstrapping algorithm, version 3.6a3 Settings for this run: D Sequence, Morph, Rest., Gene Freqs? Molecular sequences J Bootstrap, Jackknife, Permute, Rewrite? Bootstrap B Block size for block-bootstrapping? 1 R How many
24、replicates? 100 W Read weights of characters? No C Read categories of sites? No F Write out data sets or just weights? Data sets I Input sequences interleaved? Yes 0 Terminal type none 1 Print out the data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes Y to accept these of type the le
25、tter for one to change R Number of replicates? 1000 0 Settings for this run: D Sequence, Morph, Rest., Gene Freqs? Molecular sequences J Bootstrap, Jackknife, Permute, Rewrite? Bootstrap B Block size for block-bootstrapping? 1 R How many replicates? 1000 W Read weights of characters? No C Read categ
26、ories of sites? No F Write out data sets or just weights? Data sets I Input sequences interleaved? Yes 0 Terminal type IBM PC 1 Print out the data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes Y to accept these of type the letter for one to change Y Random number seed (must be odd)?
27、5(any odd number) completed replicate number 100 completed replicate number 200 completed replicate number 300 completed replicate number 400 completed replicate number 500 completed replicate number 600 completed replicate number 700 completed replicate number 800 completed replicate number 900 com
28、pleted replicate number 1000 上面的 D、J、R、I、O、1、2 代表可选择的选项，键入这些字母后敲回车键，程序的条件就会发生改变。D 选项无须改变。 J 选项有三种条件可以选择，分别是Bootstrap、Jackknife 和 Permute。R 选项让使用者输入 republicate 的数目。所谓 republicate就是用 Bootstrap 法生成的一个多序列组。根据多序列中所含的序列的数目的不同可以选取不同的 republicate。当我们设置好条件后，键入 Y 按回车。得到一个文件outfile：C:Program FilesPhylipexe ou
29、tfile. 重命名 outfileinfile 。 (3) 打开 dnadist.exe Nucleic acid sequence Distance Matrix program, version 3.6a3 Settings for this run: D Distance ? F84 G Gamma distributed rates across sites? No T Transition/transversion ratio? 2.0 C One category of substitution rates? Yes W Use weights for sites? No F U
30、se emperical base frequencies? Yes L Form of distance matrix? Square M Analyze multiple data sets? No I Input sequences interleaved? Yes 0 Terminal type ? 1 Print out the data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes Y to accept these of type the letter for one to change d D Dis
31、tance ? Kimura 2-parameter m Multiple data sets or multiple weighs? (type D or W) d How many data sets? 1000 0 Settings for this run: D Distance ? Kimura 2-parameter G Gamma distributed rates across sites? No T Transition/transversion ratio? 2.0 C One category of substitution rates? Yes W Use weight
32、s for sites? No F Use emperical base frequencies? Yes L Form of distance matrix? Square M Analyze multiple data sets? Yes, 1000 data sets I Input sequences interleaved? Yes 0 Terminal type ? IBM PC 1 Print out the data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes Y to accept these o
33、f type the letter for one to change Y 选项 D 有四种距离模式可以选择，分别是 Kimura 2-parameter、Jin/Nei、Maximum-likelihood 和 Jukes-Cantor。选项 T 一般键入一个 1.5-3.0 之间的数字。选项 M 键入 1000。运行后生成文件 C:Program FilesPhylipexe outfile。 重命名 outfileinfile 。 (4) 打开 neighbor.exe Neighbor-Joining/UPGMA method version 3.6a3 Settings for th
34、is run: N Neighbor-Joining or UPGMA tree? Neighbor-Joining O Outgroup root? No, Use as outgroup species 1 L Lower-triangular data metrix? No R Upper-triangular data metrix? No S Subreplication? No J Randomize input order of species? No, Use input order M Analyze multiple data sets? No 0 Terminal typ
35、e ? 1 Print out the data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes 3 Print out tree Yes 4 Write out trees onto tree file? Yes Y to accept these of type the letter for one to change m How many data sets? 1000 Random number seed (must be odd)? 5 Settings for this run: N Neighbor-Jo
36、ining or UPGMA tree? Neighbor-Joining O Outgroup root? No, Use as outgroup species 1 L Lower-triangular data metrix? No R Upper-triangular data metrix? No S Subreplication? No J Randomize input order of species? Yes M Analyze multiple data sets? Yes, 1000 sets 0 Terminal type ? IBM PC 1 Print out th
37、e data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes 3 Print out tree Yes 4 Write out trees onto tree file? Yes Y to accept these of type the letter for one to change Y 生成文件 C:Program FilesPhylipexe outtree&outfile。 重命名 outtreeintree；outfileinfile。 2.4.5打开 consense.exe Consensus tree
38、 program, version 3.6a3 Settings for this run: C Consensus type ? Majority rule (extended) O Outgroop root? No, use as outgroup species 1 R Trees to be treated as Rooted? No T Terminal type ? 1 Print out the sets of the species Yes 2 Print indications of progress of run Yes 3 Print out tree Yes 4 Wr
39、ite out trees onto tree file? Yes Are these settings correct? R T Settings for this run: C Consensus type ? Majority rule (extended) R Trees to be treated as Rooted? Yes T Terminal type ? IBM PC 1 Print out the sets of the species Yes 2 Print indications of progress of run Yes 3 Print out tree Yes 4 Write out trees onto tree file? Yes Y 生成文件 C:Program FilesPhylipexe outtree。 重命名 outtree jc.tre。 2.4.6打开 TreeView 打开 C:Program FilesPhylipexe jc.tre。以下操作参照前述详细说明即可。
