1、植物乳杆菌培养基的优化李 达发酵剂是影响发酵产品质量的关键因素, 它的制备需要有良好的增菌培养基, 使植物乳杆菌得以大量增殖, 从而使其在经过喷雾干燥、冷冻、冻干等处理后有足够的活菌数存活。因此优化植物乳杆菌增菌培养基是一项十分重要的基础研究工作。植物乳杆菌是泡菜、发酵谷物、发酵肉制品等重要发酵剂的组成菌之一。植物乳杆菌 K25 分离于西藏灵菇中 , 在对其进行研究时发现, 用 MRS 培养基培养该菌时, 菌落总数仅能达到6.7107cfumL- 1 左右。菌液中活菌数的增加, 可以通过培养基的优化设计来实现, 因此需要对培养基进行优化, 提高菌液中活菌数的含量。本文旨在通过对植物乳杆菌的培养
2、基进行优化, 从而获得活菌数较高的菌液, 为研制高活力的冷冻干燥发酵剂及其产品的开发奠定基础。1 材料与方法1.1 试验菌种L. plantarum K25, 分离于西藏灵菇。1.2 材料与设备胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏为生化试剂; K2HPO4、KH 2PO4、Na 2HPO4、NaH 2PO4 和各种糖类均为分析纯。722 型分光光度计、立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台、分析天平、DNG- 9240 型恒温鼓风干燥箱。1.3 培养基及培养条件活化和计数培养采用 MRS 培养基, 蛋白胨 10 g、牛肉膏 10 g、酵母膏 5 g、KH 2PO4 2 g、柠檬酸三钠 2 g、乙酸钠
3、2 g、葡萄糖 20 g、Tween 80 1 mL、MgSO 47H2O 0.58 g、MnSO 44H2O 0.25 g, 用蒸馏水定容至 1 L, 调 pH 6.26.4, 121 灭菌 15min。以 MRS 培养基为基础, 按照试验设计添加不同生长因子, 接种量 0.5%接入 150 mL 液体培养基中, 37 静置培养 24 h1.4 方法1.4.1 不同碳源、氮源、磷源的选择在 MRS 液体培养基的基础上 , 分别添加 2%(w/v) 乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖作为不同碳源; 选择胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏, 分别加入 2.5%( w/v) 作为的不同氮源; 分别加入 0
4、.2%( w/v) K2HPO4、KH 2PO4、Na 2HPO4、NaH 2PO4 作为不同磷源 , 其他组分均相同。在培养基中接入活化后植物乳杆菌, 在 37 的条件下培养 24 h, 稀释 10 倍后, 在 600 nm 条件下测定菌液 OD 值, 以 MRS 培养基为对照, 比较其对植物乳杆菌生长的影响情况。1.4.2 培养基的优化采用正交试验设计优化碳源、氮源、磷源的用量, 因素水平如表 1 所示。其中 A 因素为蔗糖,B 因素为酵母膏, C 因素为 KH2PO4, 测定菌液 OD 值。表 1 正交试验因素水平因素 Factor水平Level A B C1 1 2.0 0.12 2
5、2.5 0.23 3 3.0 0.31.4.3 OD 值测定用 722 型分光光度计, 将菌液稀释 10 倍后,以相同条件下的未接菌的培养基做参比, 在 600 nm 下测定菌液吸光度。1.4.4 菌落计数以 MRS 固体培养基为计数培养基, 采取适当的稀释倍数, 涂布于平板上, 37 培养 3648 h 后计数。2 结果与分析2.1 碳源对植物乳杆菌生长的影响不同碳源乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖对植物乳杆菌的生长的影响结果见表 2。表 2 不同碳源对植物乳杆菌生长的影响种类 对照 乳糖 蔗糖 葡萄糖 果糖吸光度（OD） 0.21 0.18 0.24 0.22 0.20由表 2 可以看出, 植物乳
6、杆菌在蔗糖为碳源的培养基中生长, OD 值为 0.24 明显高于对照, 这可能由于植物乳杆菌 K25 分离于西藏灵菇中, 而灵菇中含有大量的葡萄糖和蔗糖, 其中蔗糖能更好的被植物乳杆菌利用, 并促进其生长。而在乳糖和果糖为碳源时 OD 值分别是 0.18 和 0.20, 低于其它碳源, 不适于植物乳杆菌的生长 , 因此确定蔗糖是最佳碳源。2.2 氮源对植物乳杆菌生长的影响氮源采用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏, 牛肉膏, 以 MRS 培养基为对照, 对植物乳杆菌的生长影响见表 3。MRS 培养基中氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏, 由表 3 可以看出, 植物乳杆菌的生长在以酵母膏为单一氮源时, OD
7、 值略高于对照, 明显高于植物乳杆菌在其它氮源中的生长可能是由于植物乳杆菌 K25 分离于西藏灵菇中, 所利用的氮源与酵母膏中所含有的氨基酸同源或是氨基酸组成相似; 植物乳杆菌在以胰蛋白胨和大豆蛋白胨为氮源时生长效果较差, OD 值仅为 0.328 和 0.338; 牛肉膏是 MRS 培养基中的氮源, 单独添加时不利于植物乳杆菌的生长, 不能很好的促进菌种生长, 菌液的 OD 值最低。表 3 不同氮源对植物乳杆菌生长的影响种类 对照 胰蛋白胨 大豆蛋白胨 酵母膏 牛肉膏吸光度（OD） 0.39 0.328 0.338 0.47 0.3162.3 磷源对植物乳杆菌生长的影响磷源采用 K2HPO4
8、、KH 2PO4、Na 2HPO4、NaH 2PO4,由表 4 可以看出, 在 K2HPO4 为磷源时植物乳杆菌的 OD 值是最小值 0.256, 可能是因为 K2HPO4 的添加改变了培养基的 pH, 不利于植物乳杆菌的生长; 而以 KH2PO4、Na 2HPO4、NaH 2PO4 为磷源时 OD 值相差不多, 都在 0.3 左右; 原基本培养基中磷源即为 KH2PO4, 作为生长因子能够很好的促进植物乳杆菌的生长, OD 值为 0.38, 因此确定采用原培养基中的 KH2PO4。表 4 不同氮源对植物乳杆菌生长的影响种类 对照 磷酸氢二钾 K2HPO4磷酸二氢钾KH2PO4磷酸氢二钠Na2
9、HPO4磷酸二氢钠NaH2PO4 吸光度（OD） 0.39 0.256 0.31 0.28 0.382.4 植物乳杆菌培养基的优化根据单因素试验的结果, 设计正交试验, 因素 A、B 、C 分别为蔗糖、酵母膏、KH 2PO4, 以吸光值（OD600nm）为评价指标, 测定结果和相应的极差分析见表 5.由表 5 可以看出, 各因素对植物乳杆菌的生长影响次序依次是: 蔗糖KH 2PO4 酵母膏。蔗糖的添加量是影响指标值的最主要因素, 酵母膏添加量对指标值影响最小。表 5 正交试验因素水平因素 Factor试验号Trial number A B C OD600nm1 1.0 2.0 0.1 0.34
10、72 1.0 2.5 0.2 0.5863 1.0 3.0 0.3 0.1354 2.0 2.0 0.2 0.7445 2.0 2.5 0.3 0.7556 2.0 3.0 0.1 0.8367 3.0 2.0 0.1 0.7438 3.0 2.5 0.3 0.6879 3.0 3.0 0.2 0.735K1 0.356 0.608 0.623K2 0.778 0.676 0.688K3 0.719 0.596 0.544R 0.422 0.107 0.144当蔗糖添加量为 1%时, 不利于植物乳杆菌的生长 , 随着蔗糖添加量的增加, 指标值明显增大, 但是添加量为 3%时, 指标值下降, 说明过多的碳源并不利于植物乳杆菌的生长, 蔗糖添加量为 2%时最好。KH2PO4 和酵母膏添加量过多或过少 , 对植物乳杆菌的生长都不利, 最佳水平为 A2B2C2 的组合。3 结论a. 适合植物乳杆菌生长的培养基中, 最佳碳源、氮源、磷源分别是蔗糖、酵母膏、KH 2PO4。b. 采用正交试验优化后植物乳杆菌培养基中各因素用量为酵母膏 2.5%、蔗糖 2%、KH 2PO4 0.2%。c. 优化后的植物乳杆菌的活菌数达 3.0108cfumL- 1, 为植物乳杆菌发酵剂的进一步研究奠定了基础。
