1、小鼠骨髓细胞微核实验,环境毒理学实验,1.1 环境毒理学,1.引言,研究环境污染物，特别是化学污染物对生物有机体，尤其是对人体的损害作用及其机理的科学。,新兴科学 发展迅速,1.2 环境毒理学实验环境毒理学的研究方法,1.3 遗传毒性研究,突变(mutation)：遗传物质发生的可改变生殖细胞或体细胞中的遗传信息并产生新的表型效应的变化。,环境致突变作用,化学物质及其他环境因素导致生物体遗传机构的改变，可以导致人类的某些遗传性疾病且与癌症的发生有关,环境化学诱变物药品：抗癌药物环磷酰胺、氨苯喋啶等农药：DDT,敌敌畏，谷硫磷等工业生产中应用和产生的污染物 亚硝胺类，多环芳烃类，甲醛，苯，砷，铅
2、,1.4 致突变试验评定外源化合物对生殖细胞及体细胞的致突变性对遗传危害性做出初步评价用于环境诱变剂污染的监测及评价有价值的工具用来评价诱发癌症的可能性,遗传毒性研究新技术聚合酶链反应技术单细胞凝胶电泳试验 荧光原位杂交 转基因小鼠突变试验 基因芯片技术,常用经典方法Ames试验微核试验染色体畸变分析SCE 试验显性致死试验,根据检测的遗传学终点，可将致突变实验分为基因突变试验、染色体损伤试验、非整备体试验和DNA损伤试验。,2. 1 实验目的,学习和掌握小鼠骨髓细胞微核实验方法 和嗜多染红细胞(PCE)微核测定方法了解微核测试的原理和遗传毒理学在实际生活与工作中的应用范围及意义,2.小鼠骨髓
3、细胞微核试验,微核形成原理,微核：染色体断裂或纺锤丝受损, 在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。,2.2 实验原理,微核micronucleus,微核试验：通过观察微核的形成情况来检测断裂剂及非整备体诱发剂。,可以根据嗜多染红细胞(PCE)细胞中微核出现率，观察环境污染物对染色体完整性和染色体分离改变的影响，判定其有无遗传毒性 。,2.3 实验器材,手术刀手术剪无齿镊小型弯止血钳干净纱布带橡皮头吸管台式离心机刻度离心管,9. 电吹风机10. 玻璃蜡笔11. 2ml注射器及针头12. 载玻片及推片13. 定时钟14. 带油镜头显微镜15. 细胞计数器16. 玻璃染色缸17. 晾片架,2.
4、4 主要试剂,甲醇（分析纯） 生理盐水 小牛血清 pH6.8的磷酸盐缓冲液 分别取1/15 mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40ml和1/15 mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60ml，两者混合均匀。 吉姆萨(Giemsa)染液 阳性对照物 环磷酰胺或丝裂霉素C,2.5 实验步骤,（1）实验动物及处理 实验动物 品系：昆明种小鼠 性别：雌性雄性各半 周龄：8周 体重：18-20 g, 染毒途径,经口 经皮 经呼吸道 注射,小白鼠的灌胃方法,小白鼠的腹腔注射方法,测试气态污染物的毒性，应优先选择 哪种染毒方式？ a.经口 b.经皮 c.经呼吸道 d.注射,测试主要存在于水体、食物中的化合物的毒性
5、，应优先选择哪种染毒方式？,测试化妆品主要成分的毒性，应优先选择哪种染毒方式？, 染毒次数及取样时间,染毒时间,微核率,环境毒物诱发微核出现的高峰时间：24 - 72 h,染毒次数：4次连续染毒 每24 h染毒1次, 剂量选择,染毒组,阴性对照组,阳性对照组,最高剂量组采用该毒物的最大耐受量(或1/2 LD50)在此以下再设3-5个浓度组,等体积溶剂,环磷酰胺 50-100 mg/kg丝裂霉素C 100 mg/kg,在动物实验中不引起实验动物死亡的最大剂量或浓度,(2) 骨髓液的制备和涂片,推片的操作方法,(3) 固定 涂片自然干燥后放人甲醇中固定15 min。,(4) 染色 用新鲜配置的吉姆
6、萨使用液染色 10-15 min，取出后迅速用磷酸盐 缓冲液(pH 6.8) 冲洗染色残液， 晾干,（5）观察计数,低倍镜观察(100-400倍放大)选择细胞分布均匀、疏密适度、染色较好、形态完整的区域,油镜(1000倍放大)细胞计数,嗜多染红细胞和微核,注意区分微核和杂质,（6）数据处理和结果评价,微核率计算方法,结果评价,阳性判断标准：实验组微核率显著高于对照组， 具有重现性 具有剂量-效应关系阴性判断标准：实验剂量足够大，染毒次数足够,（7）质量保证/质量控制 (QA/QC),阴性对照：应得到阴性结果，微核自发率约为3,阴性对照异常的可能原因试剂被污染实验动物异常，实验前已接触遗传毒物操作错误,阳性对照：应得到阳性结果，各次实验结果具有重现性,阳性对照异常的可能原因无效染毒，染毒试剂已分解实验动物异常，周龄不合适，敏感度下降操作错误,注 意 事 项,1. 实验所用的器具必须洁净，小牛血清无污染。 2. 骨髓涂片上，细胞疏密程度要合适，细胞之间互不重叠。 3. 正确区分微核和涂片上的异物。 4. 实验动物年龄不宜过大。,
