1、基因工程实验流程总览,DNA提取，纯化,限制图谱,琼脂糖电泳检测片段,体外扩增PCR,目的基因制备,载体选择,DNA重组片段连接,未知核酸序列须,DNA片段大小估计,互补性黏性不互补性黏性末端平末端,限制性核酸内切酶酶切分离法简单基因组分离如质粒和病毒,物理化学法,构建基因组文库,PCR扩增,基因的化学合成,双抗体免疫法,酶促反应mRNA-cDNA,目的基因分离,双酶切部分酶切Bal31逐步切割,转座子基因定位克隆酵母双杂交,前处理防止自连,RNA提取,RT-PCR,TA克隆,蓝白选择,胶回收,表达引物PCR,载体,PCR产物回收,转化感受态细胞,构建基因组文库,真核生物有成千上万个碱基对，单
2、个未知基因在整个基因组中的比例很小且不能在体外特异性扩增，所以只能对所有基因扩增，也就是构建基因组文库。,油菜TOC33基因片的克隆,实验项目背景 国家自然科学基金项目（油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆，编号：30170500）。实验目的 通过本综合实验，掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等，得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练。,具体实验步骤,.植物基因组DNA的制备.TOC33基因片段的PCR扩增. DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化IV. DN
3、A片段的体外重组与转化V. 克隆的筛选与鉴定VI.序列分析,.植物基因组DNA的制备,取0.2g样品嫩叶至1.5mL EP管中，放在液氮中冷冻处理后，在EP管中充分捣碎，加入0.6mL 抽提缓冲液，65水浴处理10min。12,000rpm离心3min，取上清，加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀，遇有絮状沉淀，4,000rpm离心5min。沉淀用50ul TE-RNase（5.0mM Tris.HCl pH 8.0，1.0mM EDTA pH 8.0，RNase A 30ug/mL）溶解，37保温处理15min。加入二倍体积预冷的无水乙醇，-20下沉淀10min ，4,000rpm离心3min，加
4、适量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37烘干，加入50ul ddH2O溶解备用。,.TOC33基因片段的PCR扩增,引物设计，为扩增Toc33片段，用OLIG05. 0设计1对PCR引物:上游引物P1: 5一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3，下游引物P2：5一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3。在0.2mLEppendorf管内配制25ul反应体系：10PCR Buffer 2.5 ul Mg2+ 1.5 ul dNTP 1.0 ul Primer 1 1.0 ul Primer 2 1.0 ul Taq 酶 0.5 ul 模板 1.0 ul ddH2O 16.5 u
5、l,1) 94 oC 预变性 5 min2) 94 oC变性 30 sec3) 55 oC退火 30 sec4) 72 oC延伸 45 sec5) 重复步骤2)-4)30次6) 72 oC延伸10 min,琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 1)称取0.5g琼脂糖放入溶胶瓶中，再加入1ml 50TAE缓冲液，49ml 高水，置微波炉或水浴加热至完全融化，取出摇匀，则为1琼脂糖凝胶液。2)取电泳槽里面的胶板，用胶带将两端封好，调平，并放好样品梳子。3)将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入胶板，直至胶板上形成一层均匀的胶面。4)待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。5)用移
6、液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。6)接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）；选择合适的电压，开始电泳；7)当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言12cm处，停止电泳。8)将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10min后取出，用清水冲洗。将胶放于凝胶成像系统内拍照，以观察样品在琼脂糖凝胶中的带（EB有剧毒，戴手套操作）。,电泳染色后，在紫外分析仪上切取所需要的条带，按1克胶：1000添加提取缓冲液，放在60度的金属浴中溶解。然后把溶液转移到试剂盒专用管中，6000转/分离心1分钟；倒掉上清，再加入500微升的extraction buffer,12000r/m
7、in离心1分钟；倒掉上清，加入750微升的wash buffer ,12000r/min离心1分钟；倒掉上清，重复步骤三；倒掉上清，在12000r/min下空转1分钟；把带有膜的管子换到新的EP管中，加入3050微升的水，静置1分钟，12000r/min离心一分钟，即得到所要回收的片断。此样品可用来做酶切等。,. 琼脂糖凝胶上DNA的回收与纯化,IV. DNA片段的体外重组加试剂顺序由上到下（用500ul的EP管装），加完之后混匀，短时离心，用封口胶封口。将EP管放入金属浴当中37度酶切两个半小时左右，取出酶切产物，用试剂盒进行割胶回收进一步纯化酶切片断以进行连接反应。,酶切体系： 40.0u
8、lddH2O 9.0ul10Buffer 4.0ul DNA 25.0ul Xba I、 1.0ul Hind III 1.0ul,连接反应：,连接体系： （20.0ul） 酶切产物 3.0ul Buffer 1.0ul 载体 14.0ul Liagse 2.0ul,加试剂顺序由上到下（用500ul的EP管装），加完之后混匀，短时离心，用封口胶封口。将EP管放入金属浴当中16度连接过夜。,IV. DNA片段的转化1. 从液氮中取出感受态细胞，完全融化后，用移液枪将连接产物加入感受态细胞中，温柔混匀，在冰上放置半个小时。2. 42OC热激90sec。再在冰上放10min，然后导入SOC（1.5m
9、lEP管）中，在37OC摇床上200rpm进行振荡一小时。3. 在这段时间里可以准备平板，25ml左右加了抗生素的60度左右的LB固体培养基倒入事先灭菌的培养皿中，在表面涂布上X-gal和ITPG;4. 取出摇得菌液在离心机上6000转每分钟离心五分钟。然后将大部分培养基倒出，剩余大概五十微升左右的SOC即可。注意不可将沉淀倒出。5. 用移液枪将沉淀吹散均匀，将其加入事先倒好的平板上，加入涂布玻璃珠进行涂布。涂布均匀后将平板倒置放于37OC培养箱内过夜培养。第二天从转化的平板上挑去白色的菌落以验证是否是阳性克隆,V. 克隆的筛选与鉴定1.用移液枪在1.5mlEP管中加入液体LB培养基500ul
10、，再用灭过菌的牙签在生长蓝白斑的平板上挑取阳性克隆放于EP管中，丢弃牙签，盖紧管口，用报纸包好放到37OC，200r/min的摇床中过夜培养；2.EP管出现混浊，用质粒提取试剂盒提取质粒。3.对于得到的质粒再酶切电泳检测阳性克隆，如果酶切后的电泳图上出现了与插入片断相应大小的条带，证明是此单菌落是阳性克隆，否则是假阳性的。,试剂盒质粒回收过程,把过夜培养菌液，10000r/min离心1分钟，倒掉上清液；向菌体中加入质粒回收试剂盒中的SolutionI400微升，震荡，直到沉淀的菌体完全悬浮；然后加入400微升的SolutionII，轻轻地颠倒混匀，然后在室温下放置2分钟；加入525微升的Sol
11、utionIII，颠倒混匀，直到出现白色的絮状沉淀，10000r/min离心10分钟；把上清液转移到试剂盒专用管中，10000r/min离心1分钟;倒掉溶液，向管子中加入600微升的buffer HB，10000r/min离心1分钟；倒掉溶液，加入750微升的wash buffer, 10000r/min离心1分钟;重复上一步骤7次；倒掉溶液后空转一次，以尽量除尽残余的wash buffer ;将带有膜的管子转移到新的EP管中，加入100微升的水，静置1分钟，10000r/min离心1分钟，即得到所需要的质粒。,VI.序列分析,获得的阳性单克隆送样测序，测序结果的同源性比较采用GenBank中
12、的BLAST分析程序，基因序列比较运用DNAsist软件。,实验起始材料的选取和准备mRNA的提取、纯化目标片段的克隆和分析DNA、RNA的提取、纯化和分析克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析基因转化实验及转基因结果分析,一、实验起始材料的选取和准备,水稻卵细胞的分离,分离准备工作,材料的速冻,长期保存,人工气候箱、制冰机,超净工作台、显微操作系统,RNase-free 耗材、液氮罐,超低温冰箱,RNase 抑制剂,二、卵细胞mRNA的提取、纯化,Oligotex系列试剂盒,细胞裂解,匀浆,去蛋白和细胞残渣,温浴并结合,洗脱,去盐和回收,旋涡混匀器,离心机,恒温水浴锅,离心机、旋涡混匀器
13、,200 烘箱,DEPC 、RNase-free DNase I 、RNase-free 耗材,三、目标片段的克隆和分析,利用SMART cDNA文库构建试剂盒构建水稻卵细胞cDNA文库；目标基因的获得；通过噬菌体载体自切割或T-Vector、平末端载体克隆获得目标质粒；利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序；,1.通过SMART技术构建cDNA文库,第一链的合成,第二链的合成和扩增,酶切、纯化和片段分离,cDNA检测,插入载体并包装,文库质量检测,文库扩增及保藏,恒温水浴锅、制冰机,RTase、RNase抑制剂,PCR仪,高保真Taq酶,恒温水浴锅、离心机,限制性内切酶、过滤柱,电泳仪器、
14、凝胶成像系统,琼脂糖,恒温水浴锅,超净工作台、烘箱、PCR仪,培养基,超低温冰箱,DMSO,2.目标基因的克隆,利用特异探针，通过核酸杂交的方法或利用特异的抗体，通过抗原-抗体反应进行文库目标基因的筛选将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙膜，并于核酸交联仪中固定。在杂交箱中利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗膜（探针标记：放射性和非放射性）将噬菌体培养于平板，于42培养几小时后，于37用IPTG诱导融合蛋白的表达并印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行杂交利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出目标基因利用GSP，以文库为模板通过PCR扩增出目标基因，并通过电泳、凝胶成像系统检测。利用文库载
15、体序列和已知的目标基因的序列设计通用引物和GSP，通过5RACE和3RACE扩增出目标基因的5和3端序列。并通过电泳、凝胶成像系统检测。通过5RACE和3RACE克隆已知部分序列的目标基因,四、DNA、RNA的提取、纯化和分析,包含有目标基因的质粒的获得 对于通过筛库技术获得的目标基因，通过噬菌体载体的自切割作用生成目标质粒。水稻基因组DNA的提取、纯化和分析水稻各器官Total RNA的提取、纯化和分析,质粒提取、分析,常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放出质粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用无水乙醇沉淀质粒DNA质粒提取试剂盒：裂解方法一致。裂解完成后利用过滤柱纯化出质粒DNA质粒提取
16、后，根据以后实验要求利用不同的限制性内切酶在水浴锅中进行酶切电泳，用凝胶成像系统分析测序,水稻基因组DNA的提取、纯化和分析,利用SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂盒提取水稻基因组DNA：利用SDS在高钾离子浓度的情况下能沉淀蛋白和多糖等杂质的原理提取基因组DNA利用酚-氯仿抽提或过滤柱纯化基因组DNA水稻基因组文库的构建利用特异的探针，通过Southern blotting检测目标基因的拷贝数,水稻各器官Total RNA的提取、纯化和分析,分离所需的水稻各器官组织，并利用Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总RNA：将材料裂解后，通过过滤柱纯化出总RNA在RNase-free的
17、情况下，通过甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量利用特异性的探针，通过Northern blotting检测目标基因在各器官的表达情况,Southern blotting,基因组DNA完全消化,探针制备,琼脂水平电泳,比活性测定,印迹转膜,DNA交联,限制性内切酶、恒温水浴锅,手提紫外灯、电泳仪器,真空转膜仪,紫外交联仪,同位素检测仪,探针制备试剂盒,尼龙膜,制备好的尼龙膜,探针（放射性或非放射性）,杂交,杂交箱,放射自显影,荧光,同位素检测仪磷屏成像系统,荧光扫描成像系统,克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析,克隆化基因的表达表达蛋白的纯化 功能分析,克隆化基因的表达,基因的克隆：利用高保
18、真的Taq酶和合适的反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一致的DNA片段（通过测序确证）体内表达：选择合适的表达载体插入目标片段。利用化学方法或电转化仪等手段转入细胞表达体外转录和翻译系统：兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物等,表达蛋白的纯化,SDS聚丙烯酰胺胶回收：利用SDS聚丙烯酰胺胶分离不同大小的的蛋白。利用6HIS、GST（谷胱甘肽）等和亲和树脂纯化：通过表达目标基因的融合蛋白，利用亲和层析洗脱出目标蛋白自动核酸/蛋白纯化工作站,目标蛋白功能分析,抗体的制备：多抗、单抗DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等蛋白质-蛋白质相互作用研究：酵
19、母双杂交系统、噬菌体表面展示技术等,蛋白体内表达研究,Western blotting：利用抗原-抗体反应，对蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定量免疫组织化学研究：通过切片技术和免疫反应，利用特异抗体检测特定蛋白在组织细胞内的表达和定位蛋白质芯片系统,基因转化实验和转基因结果分析,转基因载体的构建：载体、农杆菌、特殊抗生素植株的转化：叶盘转化法、基因枪植株的筛选：荧光检测、GUS染色、PCR法基因功能分析：激光共聚焦显微镜、FISH等,连接反应, 在灭菌的0.5mL离心管中进行。 10L体积反应体系中： 2快速连接缓冲液 5L 目的基因的双酶切产物 XL pMal-c2x质粒双酶切产物 XL
20、 T4-DNA连接酶 0.3L 轻轻混匀，室温下放置过夜。,注意事项：目的基因和 c2x质粒双酶切产物的加入比例应根据电泳结果而定，使加入的2片段的浓度比为1：1,剩下的酶切片段不要丢掉，留做转化时做对照,感受态菌的制备,（1）E.coli TB1菌株37过夜培养以复苏菌种，取过夜培养的菌液1mL加入到50 mL LB培养基中，37，230 r/min振荡培养3 h，至A600约为0.4左右。（2）无菌条件下，将50mL菌液转移至离心管中，冰上放置10 min，使培养物冷却至0。（3）在预冷4的离心机上以4000 r/min离心10min，弃去上清，加入5mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶
21、液重悬沉淀，冰浴上放置10 min。（4）以4000r/min在4离心10min，弃去上清，每50mL初始培养物用2mL预冷的含有10%20%甘油的0.1mol/LCaCl2溶液重悬细胞沉淀，100L/管分装，于-70条件下，可保存半年。,注意事项：细胞一旦离开培养基，实验操作要轻柔。整个实验过程中注意将细胞置于冰上,不能摇过了！选用处于对数生长期的细胞,预先冷却,pMal-ade重组质粒的转化,（1）向分装有100LE.coli TB1菌株感受态细胞的EP管中加入2 L的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合内容物，冰浴上放置30 min。（2）将该EP管放入预加温至42的水浴中，放置90s
22、，快速转移到冰浴中，使细胞冷却12 min。 （3）向EP管加入900 L LB培养基，转移至37摇床上，150r/min，温育45 min以复苏菌株。（4）将200L上述培养物加到含100g/mL氨卞青霉素的LB平板上（平板表面涂有20mg/mL的X-gal 40L和20mg/mL的IPTG 40L），以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。（5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37过夜培养；,水浴温度要准确，热击时不要摇动EP管,UNIQ-10柱式质粒小量抽提,将过夜培养的12ml细菌12,000rpm离心15秒，彻底去除上清。加入100l Solution I，用枪头
23、或振荡器充分悬浮细菌。加入200 l Solution II，立即温和混匀（倾斜45度角，顺一个方向，慢慢旋转离心管），使细菌裂解，室温放置2分钟。加入350l Solution III，立即上下颠倒510次，使之充分中和，室温放置2分钟。12,000rpm，离心5分钟。 将步骤5中上清转移到套放于2.0-ml收集管内的UNIQ-10柱中，8,000rpm室温离心15秒。弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500l Wash Solution到UNIQ-10柱，10,000rpm室温离心30秒。重复步骤7。弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管中，10,0
24、00rpm室温离心30秒以彻底去除Wash Solution。将UNIQ-10柱放入新的洁净1.5-ml离心管中，加50l Elution Buffer，室温放置2分钟后，10,000rpm室温离心1分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。,注意：对于低拷贝数的质粒，请用25ml细胞，同时按比例相应提高Solution I，II和III的用量。在执行步骤5后，将上清分批加入到UNIQ-10柱中，重复步骤6，直至处理完所有样品。不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染。不要吸取沉淀，否则会出现基因组 DNA和蛋白质污染。：（1）如果要提高质粒的浓度，可以用30l Elution Buffer
25、，37或50下放置2分钟，10,000rpm室温离心1分钟。（2）5580洗脱可提高回收率1020个百分点。,PCR筛选,1、调整模板（ pMal-ade重组质粒）浓度至 5 ng/ L。2、按下列体系配制反应混合液，混匀， Template DNA 1.0 L（ 20 ng ）10 buffer 2.0 LMgCl2（25mmol/L） 1.5 LPrimer 1 (10mol/L) 0.5 LPrimer 2 (10mol/L) 0.5 LdNTPs （2mmol/L） 2.0 LTaq酶 （5U/L） 0.5L加ddH2O至 20L,外源基因的特异引物：引物1（5-CCG GAA TTC
26、 TTG AAT AAA GAA GCG CTA GTC3）和引物2（5-CGG GGA TCC GTC GAC TTA TTG CAG TGA TAT GTG TTG3）。,3PCR 反应循环条件设置 94变性反应1min； 55退火反应45s； 72延伸反应1min。 进行25个循环后，最后一个循环72延长至10min。迅速冷却4。 4、检测 加 2L溴酚蓝和10L 反应产物，混匀，取 15L 反应产物点样电泳。5、成像分析 在 1% 的琼脂糖凝胶上点样电泳0.51h，电泳结束后EB 染色1520min，凝胶成像分析结果。,pMD18-T Vector,pMD18-T Vector是一种高
27、效克隆PCR产物(TA Cloning) 的专用载体。这种载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体（参见第12章基因工程的载体）的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3端添加T 而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3末端添加一个 A 的特性，所以使用这种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。,EcoR V -T-cloning site,cDNA文库应用分离新基因的方法,发现并分离克隆新基因始终是分子生物学研究的主要任务和目的，虽然cDNA文库的用途很多，但是，应用于分离新基因
28、是其最重要的用途。前述的不管是哪种类型的cDNA文库，都可以用于分离新基因，只是使用的方法有差异。分离方法主要有两种：第一，对于非全长 cDNA文库，即不管是经典的cDNA文库方法或差减法构建的cDNA文库，需要利用已经获得的新cDNA序列片段，通过RACE方法获得新基因的全长序列。第二，利用全长cDNA文库与目的基因片段作为探针的杂交筛选。从非全长cDNA文库中筛选新基因 3.1.1RACE法 RACE文库即快速扩增cDNA末端法 (RapidAmplificationofcDNAEnd，RACE)只需知道mRNA内很短的一段序列即可扩增出其 cDNA的5(5RACE)和3端(3RACE)。
29、该法的主要特是利用一条根据已知序列设计的特异性引物和一条与 mRNA的PolyA(3RACE)或加至第一链cDNA3端的同聚尾(5RACE)互补的通用引物，由于同聚体并非良好的PCR引物，同时为了便于RACE产物的克隆，可向同聚体引物的5端内加入一内切酶位点。所用的cDNA模板可以使用多聚dT引物延伸合成(3，5-RACE均可)。当RACEPCR产物为复杂的混合物时，可取部分产物作模板，用另一条位于原引物内侧的序列作为引物与通用引物配对进行另一轮PCR(巢式PCR)。早在1988年，FROHMAN等即用此方法成功地获得了4种mRNA的5合3末端序列。,用PCR法从cDNA文库中快速克隆基因 通
30、过对文库的筛选或适用简并引物进行PCR反应，常常只能获得不完整的cDNA片段。为了得到cDNA全长，常常要重新筛选文库。重新筛选文库工作量大，RACE虽然为此提供可方便，但应用该方法需重新提取mRNA和反转录。而用PCR 法从cDNA文库中快速克隆基因的方法，只需提取噬菌体DNA，按保守序列设计PCR引物便可将未知片段进行克隆。特别是在基因的两端变异较大而中间某区域保守的情况下，用PCR法很容易获取cDNA的全长。同一转录产物，又是存在着不同的拼接方式，通过筛库的办法同时将不同拼接方式的克隆筛选出来可能性较小，而使用PCR扩增后，有利于观察到不同的拼接方式。另外，为研究基因在不同组织中表达情况
31、，常根据差异显示法找出特异的mRNA。,从全长cDNA文库中进行杂交筛选,标记探针cDNA文库筛选法 cDNA文库通常涂抹到母盘培养基上，然后再把这些菌落的样品吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上；这时加入标记的探针，如果出现杂交信号，那么从母盘上就可以把包含杂交信号的菌落分离、培养出来。以此筛选出阳性克隆，进行序列分析，以获得cDNA全长。该方法能避免 PCR扩增的非特异性扩增或错配，是一种比较准确可靠的cDNA克隆方法。主要缺点是克隆过程需要一系列的酶促反应、产率低、费时长、工作量大。该方法适合于表达丰度高的基因的筛选分离。用于做标记探针的DNA片段可以是其它生物的基因片段，在这种情况下筛选出来的
32、基因往往是已分离基因的同源基因；如果用于做标记探针的DNA片段是通过新分离蛋白质的氨基酸反推设计的DNA序列，或者是特异分子标记子 DNA序列，那么可以筛选得到新功能基因。 反式PCR 反式PCR克隆cDNA全长的基因原理是：双链cDNA合成后进行尾尾连接，环化的cDNA用位于已知序列内的限制性内切酶酶切位点造成缺口或用NaOH处理使之变性，然后用2条基因特异性引物对重新线性化或变性的cDNA进行扩增。反式PCR的优势在于，它采用了2条基因特异性引物，因此不易产生非特异性扩增。该方法可以快速、高效地扩增cDNA或基因组中已知序列两侧位置的片段。,采集5个自愿者的DNA样品,构建3种不同插入子大小的基因组文库2Kb, 10Kb和50Kb,完成约2700万次插入子末端测序,总长14800Mb,GeneBank下载104018个BAC末端顺序,PFP发表的公开数据主要为BAC克隆的顺序,共4443.3Mb,随机测序与序列组装方法和指导测序与序列组装方法相结合进行序列组装,
