1、第二章 基因工程的酶学基础,第一节 限制性内切酶第二节 DNA连接酶第三节 DNA聚合酶和反转录酶第四节 DNA修饰酶第五节 外切核酸酶第六节 单链内切核酸酶第七节 RNA酶,核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。,基本概念及其生物功能,特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase）特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase）非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA,从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶,按水解断裂核酸分子的方式:,根据作用的核酸底物不同:,
2、基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。,工具酶,1、限制-修饰系统2、限制性核酸内切酶的命名和类型3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、影响限制性内切酶活性的因素5、限制性内切酶对DNA的消化作用,第一节 限制性核酸内切酶,限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。,限制性核酸内切酶概念,2. 性质,内切酶,主要来源于原核生物,即在核
3、酸分子链的内部制造切口的酶。形成5-P和3-OH末端,自我保护作用,3. 功能,细菌的限制和修饰系统（R/M体系）,1. 来源,任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制,大肠杆菌B,大肠杆菌K,phage (B),EOP=10-4（限制作用）,EOP=10-4（限制作用）,EOP=1（修饰作用）,修饰的phage (K),人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。,寄主的限制与修饰现象,E.O.P 成斑率efficiency of plating
4、,EOP=1,限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。,（1）限制（Restriction）,限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰（Modification）, Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase),GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基, Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase),CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基,修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物
5、质的目的。,（3）限制与修饰系统相关的三个基因, hsd R: 编码限制性内切酶, hsd M: 编码限制性甲基化酶, hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达,这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断,这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰 DNA的作用。,作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。,2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点-（修饰）,1.大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修饰系统。,限制和修饰作用的分子机制
6、,3. 外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 -（限制）,4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。,基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。,1、限制-修饰系统2、限制性核酸内切酶的命名和类型3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、影响限制性内切酶活性的因素5、限制性内切酶对DNA的消化作用,第一节 限制性核酸内切酶,1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：,限制性内切酶的命名
7、,用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。,大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示,2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。,如 Hind ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒,3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。 如Hind ：d菌株中发现的第二个酶,4. 所有的限制酶，除
8、以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。,如 R.Hind 表示限制性内切酶 M.Hind 表示相应的甲基化酶实际应用中，R常被省略。,EcoR I,Escherichia,属名,Coli,种名,Ry13,株系,编号,若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。,目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、型。,限制性内切酶的类型,二、限制性内切酶的类型 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、型。,基因工程中使用,注： SAM为S腺苷甲硫氨酸,首先由M
9、.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。,（1）识别位点序列,EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,型限制性内切酶的基本特性,如 EcoB和 EcoK。,未甲基化修饰的特异序列。,N：表示任何一种核苷酸,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）,（3）辅助因子,在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割位点,首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是
10、Hind 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA的来源无关。,A B N B A,A B N B A,或,型限制性内切酶的基本特性,（1）识别位点序列,识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：,（2）切割位点,A A G C T T,T T C G A A,A,B,C,D,DNA,DNA,Hind,Hind切割位点,核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用,在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游24-26bp)，但不是对称的回文顺序，且在识别序列旁边一定数目核苷酸的位置切割。 反应需要ATP、 M
11、g2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,EcoP1: AGACC,EcoP15: CAGCAG,在基因工程操作中用途不大。,型限制性内切酶的基本特性,IV型限制性内切酶,新鉴定出来的一类限制酶。只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖羟甲基化的DNA序列。,除EcoKMcrBC外，识别序列尚未确定，目前尚无应用。,核酸限制性内切酶的类型及主要特性,1、限制-修饰系统2、限制性核酸内切酶的命名和类型3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、影响限制性内切酶活性的因素5、限制性内切酶对DNA的消化作用,第一节 限制性核酸内切酶,识别序列,识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转
12、对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。,4bp Hpa C CGG Hae GG CC 5bpAva G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamHG GATTC SmaCCC GGG11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstX CCANNNNN NTGC,1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。2、这两股DNA链若按同方向阅读（如5 3），其核苷酸顺序相同。,5GAA TTC3 3CTT AAG5,特点有二：,回文序列：反向重复序列，双链DNA中含有两个结构相同，方向相反的序列,5GTNAC3 3CANTG5,限制性核酸内
13、切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3 位酯键产生两个末端，末端结构是5-P和3-OH，产生3种不同的切口。,切割方式,与II型核酸内切酶有关的几个概念,粘性末端(cohesive ends):因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。平 末 端(Blunt end): 因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。,1. 5突出的末端,2. 3突出的末端,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,这比连接两个平齐末端容易得多。,粘性末端
14、的意义, 连接便利,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。, 补平成平齐末端,B 3末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。,A 5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。, 末端标记,3. 平头末端,平齐末端的特点,连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接。,粘性末端与平齐末端连接的处理方法,）添补法： 利用DNA聚合酶 (klenow fragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。,）削除(平)法 利用S1和Bal3
15、1等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端,不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。,识别位点和切点完全相同 如Hind 和Hsu I,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,同裂酶（Isoschizomer), 完全同裂酶：,识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。, 不完全同裂酶：,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAG
16、T-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl ,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho ,U代表嘌呤；Y代表嘧啶。,同尾酶(Isocaudamers）,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,5-G3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl ,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl ,Sau 3A,1、限制-修饰系统2、限制性核酸内切酶的命名和类型3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、影响限制性内切酶活性的因素5、限制性内切酶对DNA的消化作用,第
17、一节 限制性核酸内切酶,1. 标准酶解体系的建立,一个单位（U）的限制性内切酶定义： 在合适的温度和缓冲液中，在20l的反应体系中，1h完全酶解1gDNA所需要的酶量。,推荐：稍过量的酶（2-5倍）和较长的反应时间,限制性核酸内切酶的反应条件,2. 酶解过程,配酶解体系 混匀 反应终止 酶解结果鉴定, 酶解体系,一般20l，保证酶液体积不超过反应总体积的10%前提下，尽量降低反应总体积。,加样顺序一般是：,ddH2O buffer DNA 酶,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：, 混匀,移液枪吹打或手指轻弹管壁,若底物分子很大（如基因组DNA），应避免强烈振荡。,混匀后微量高速离心机
18、进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。,反应终止,三种方法：,）加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度 10mmol/L; 加十二烷基硫酸钠（SDS） 至终浓度0.1%(W/V),）65加热20min或者70加热10min,）酚/氯仿抽提, 酶解结果鉴定,快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察然后决定是否终止反应,限制性核酸内切酶的反应条件 完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。 局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。 通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。,酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带,造成非特异性切割；不正确的操作，导致其它内切酶污染；底物DNA中
19、可能存在其它DNA污染。,电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常,底物DNA不纯；内切酶不纯；酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常,DNA中的杂质如蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、NaCl等都会影响酶的活性。,1. DNA的纯度,一般采取, 纯化DNA 加大酶的用量 （510U酶/ g DNA ） 延长保温时间 （34h） 扩大反应体积，使潜在的抑制因素被稀释（ 20 l） 加入亚精胺提高消化作用，需要适当的温度,影响限制性内切酶活性的因素,2. DNA的甲基化程度,大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：,dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dc
20、m甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 ，少数例外。,3. 温度,酶切超螺旋DNA分子，所需酶量多于线性DNA分子；最高可达20倍；,4. DNA分子的构型,对同一DNA分子上不同位置的识别序列，切割效率具有位点偏爱性；,识别序列的侧面序列影响酶切效率。 “保 护 碱 基”,是影响限制酶活性的重要因素。,5. 缓冲液(Buffer),缓冲液的化学组成：10Xbuffer,MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）： 防止酶的氧化，保
21、持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等： 提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活 ；,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性” （star activity）现象。 EcoRI*代表EcoRI的星号活力。 星活性的特点: 限制酶识别序列特异性降低,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,EcoR I 和BamH I 等都有*活性。EcoR I *,在低盐、高pH（8）时可识别和切割,GAATTA、AAATTC、GAGTTC等,GAATTC,EcoR I：,使用的时候要特别注意！,概括起来，
22、诱发星活性的因素有如下几种：（1）高甘油含量（5, vv）；（2）限制性内切核酸酶用量过高（100UugDNA）；（3）低离子浓度（25 mmolL）；（4）高pH（8.0以上）；（5）含有机溶剂，如DMSO（二甲基亚砜 ），乙醇等；（6）有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。,但在实际应用中，一般要用稍过量的酶（1g加25U酶）反应较长的时间，才能达到完全酶解。但是不能过分加大酶的用量,酶过量对酶切反应的影响：1）酶过量（一般为100U/gDNA）会影响识别序列的正确性，如：BamHI 的正常识别序列: GGATTC ；酶过量识别序列 NGATCN2）酶
23、制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影响其识别的专一性，诱发星号活力。,6. 酶对消化效率的影响,1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下1h，完全水解1gDNA所需的酶量,1、限制-修饰系统2、限制性核酸内切酶的命名和类型3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、影响限制性内切酶活性的因素5、限制性内切酶对DNA的消化作用,第一节 限制性核酸内切酶,限制性内切酶对DNA的消化,1. 内切酶与识别序列的结合模式,1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现II型限制性内切酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。,GAATTC,CTTAAG,2. 双酶切消化,两种不同的限制酶切割同
24、一种DNA分子-构建载体。,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用两种酶均适用的缓冲液，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。,低温酶先切，然后升温，加入高温酶再切,双酶切反应体系,内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开,1,2,3,4,1,2,3,4,3 完全消化,DNA分子的G+C含量为50%，而且4种碱基的分布是随机的。最终片段大小是4nbp,只有有限数量的酶切位点被切开,通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。,1,2,3,4,1,4,4 局部消化,限制性核酸内切酶的应用： 重组DNA前的切割 构建新质粒 构建物理图谱 DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA 制备DNA探针 亚克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究,本节重点掌握的内容 1、限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。 2、II型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响酶活性的因素。,第二章 基因工程的酶学基础,第一节 限制性内切酶第二节 DNA连接酶第三节 DNA聚合酶和反转录酶第四节 DNA修饰酶第五节 外切核酸酶第六节 单链内切核酸酶第七节 RNA酶,
